相关热词搜索：
【关键词】 人参
［摘要］ 目的 观察人参皂苷（Rg2）对大鼠低氧海马神经元的保护作用及其机制。方法 取新生Wistar大鼠海马神经元体外培养14 d，随机分为对照组、5 μmol/L尼莫地平组（尼莫地平组）、Rg2 0.025 mmol/L组（Rg2 1组）、Rg2 0.050 mmol/L组（Rg2 2组）。将相应药物加入到培养液中孵育4 h后，连续充以体积分数0.95 N2+体积分数0.05 CO2混合气体，建立急性低氧细胞模型。台盼蓝染色计数存活细胞，吉姆萨染色观察细胞形态，荧光分光光度计法测细胞内Ca2+浓度。结果 尼莫地平组、Rg2两个剂量组的细胞死亡率均明显低于对照组，以Rg2 2组最低，差异均有显著性（χ2=3.37，P<0.05）。海马神经元细胞内Ca2+浓度在尼莫地平组、Rg2两个剂量组均明显低于对照组，以Rg2 2组最低，差异均有显著性（F=466.58，q=6.76~48.82，P<0.01）。结论 Rg2可显著降低体外培养大鼠低氧海马神经元的细胞死亡率，其机制可能是通过减少Ca2+内流而发挥作用。
［关键词］ 人参皂苷；缺氧，脑；海马，神经元；钙
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the neuroprotective effect and its mechanism of Rg2 in anoxic cultured hippocampal neuronal cells in newborn rats. MethodsAnoxic cultured hippocampal neuronal cells of newborn rats were pided into control group, nimodipine group (5 μmol/L), Rg2 1 (0.025 mmol/L) group and Rg2 2 (0.050 mmol/L) group. The activities of the neurons were tested by trypan blue staining. The morphological changes were observed by Giemsa staining. The concentration of cellular free calcium in the cells was tested by Fluorescence spectrophotometer (Fura2). Results In vitro, compared with the control group, nimodipine and Rg2 significantly increased the activities of hippocampal neuronal cells, decreased the apoptosis rate and the concentration of cellular free calcium in the cells, and the most effective in Rg2 0.050 mmol/L group. ConclusionThe Rg2 could protect hippocampal neuronal cells against anoxia by decreasing the concentration of cellular free calcium in the cells to inhibit the cell death.
［KEY WORDS］Rg2; hypoxia, brain; hippocampus, neurons; calcium
细胞凋亡是脑缺血后神经细胞死亡的主要形式［1］。目前对缺血性细胞凋亡的确切机制仍不明确，有人认为，细胞质中Ca2+含量的增加是细胞凋亡的启动因素，是激活内源性核酸内切酶降解DNA的先决条件［2］。研究结果表明，Ca2+内流导致细胞内Ca2+超载而触发的一系列生化改变和诱导的相关基因的表达，可能是导致海马细胞损伤的重要原因［3］。现代药理学研究证明，人参皂苷(Rg2)是人参的主要有效成分之一，有抗细胞凋亡及Ca2+通道阻滞作用［4］。本实验旨在探讨Rg2对体外培养低氧海马神经元的保护作用及其机制，为缺血性脑血管病的临床治疗提供理论和实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物及来源 新生Wistar大鼠20只，清洁级，由青岛市药品检验所动物实验中心提供。
1.1.2 主要药品与试剂及来源 Rg2由吉林省中医中药研究院提供；尼莫地平购自德国拜耳公司；DMEM、马血清购自Gibco公司；胎牛血清由杭州四季青生物材料工程公司生产；多聚赖氨酸为Sigma公司产品。
1.1.3 主要仪器设备及来源 OLYMPUS，BX50，PM20系统显微镜（日本）；PM6 OLYMPUS解剖显微镜（日本）；二氧化碳细胞培养箱（上海福玛实验设备有限公司）；超净工作台（YJ型，苏州市洁净技术研究所）。
1.2 方法
1.2.1 海马神经元的培养 采用文献［5］的细胞培养方法。取新生1~3 d的Wistar大鼠，消毒、断头，1期王双燕，王守彪，沈若武，等人参皂苷对体外培养低氧海马神经元的保护作用43分离出双侧海马，剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块，加入1.25 g/L胰酶消化30 min（中间轻轻振荡几次），用含有体积分数0.10胎牛血清及体积分数0.10马血清的生长培养液终止胰酶的作用，制成细胞悬液（1.0×109/L），接种到6孔板中,每孔2 mL，置于37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中，培养24 h后更换维持培养液（含体积分数0.05胎牛血清、体积分数0.10马血清），以后每3 d半量换维持培养液一次，第4天加入阿糖胞苷，其终浓度为5 mg/L，每皿25 μL。细胞培养至10 d用于以下实验。
1.2.2 神经元鉴定 采用尼氏染色法。取培养海马神经元，经0.02 mol/L PBS（pH 7.4）漂洗1~2次，40 g/L中性甲醛溶液固定1 h，PBS漂洗后，置于体积分数0.10甲苯胺蓝染液中染色20 min，体积分数0.95乙醇分色，37 ℃干燥，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察。
1.2.3 分组及给药 将培养10 d的海马神经元分为以下4组：对照组、尼莫地平5 μmol/L组（尼莫地平组）、Rg2 0.025 mmol/L组（Rg2 1组）和Rg2 0.050 mmol/L组（Rg2 2组）。每组设24个复孔，将相应的药物加入到细胞培养液中，对照组加等量的维持培养液。
1.2.4 低氧模型的制备［6］ 将已分组给药的细胞继续培养4 h后，移入37 ℃恒温密闭容器中，连续充以体积分数0.95 NO2+体积分数0.05 CO2混合气体，流速为20 mL/min，持续1 h。
1.2.5 细胞形态观察 采用吉姆萨（Giemsa）染色法。将经过上述处理的海马神经元贴片细胞，经甲醇/冰乙酸（V/V=3∶1）混合液固定10 min，浸入Giemsa染液中10 min，晾干，中性树脂封片，光学显微镜下观察。
1.2.6 Ca2+浓度测定 将上述处理过的贴壁细胞，用1.25 g/L胰酶消化30 min，制备成细胞悬液，每组分成4份样本，每份样本为2 mL，加入钙荧光探针（Fura2/AM）15 μL（终浓度为5 μmol/L），经37 ℃恒温水浴振荡孵育30 min，以1 000 r/min离心10 min后，弃去上清，加入羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶液2 mL，吹打沉淀制成悬液。重复上述步骤，最后制成2 mL重悬液，荧光分光光度计测500 nm处的发射波长，300~400 nm激发波长测定吸光度(A)。并按文献［7］所提供的公式计算Ca2+含量(［Ca2+］i)。
1.3 统计学处理
应用CS 2000软件对实验结果先进行方差齐性检验，若方差不齐，则先行数据转换或用秩和检验；若方差齐，则进行F检验。
2 结 果
2.1 细胞存活率的计算
分离出的海马细胞在接种之前，制备109/L细胞悬液，用2 g/L台盼蓝染色，显微镜下观察，死亡细胞呈蓝色，活细胞不着色，细胞存活率为97%。
2.2 神经元的鉴定经尼氏染色，光学显微镜下观察，可见海马神经元胞质染蓝色，胞核无着色，表现为空泡状核的典型特征。
2.3 细胞形态光学显微镜下，可见对照组大部分细胞核固缩、边集或破碎，染色变深，细胞膜皱褶、卷曲、出泡。尼莫地平组少量的细胞核固缩、边集或碎裂。Rg2 1组仍有一部分细胞核固缩、边集、破裂，但数量已经很少。Rg2 2组的大部分细胞核染成蓝紫色，胞浆淡粉色。每组随机选择10个视野，计算细胞死亡率，对照组细胞死亡率明显高于Rg2 1、2组，以Rg2 2组最低，差异有显著性（χ2=3.37，P<0.05），见表1。
2.4 各组海马神经元内［Ca2+］i比较对照组细胞内［Ca2+］i最高，尼莫地平组细胞内［Ca2+］i仅次于对照组，且均明显高于Rg2 1、2组，以Rg2 2组最低，差异有显著性（F＝466.58,q=6.76~48.82，P<0.01）。见表1。
表1 Rg2对低氧损伤海马神经元细胞死亡率以及［Ca2+］i的影响（略）
3 讨 论
海马是脑内对缺血、低氧最为敏感的部位之一。本实验采用新生大鼠海马神经元培养，建立低氧损伤细胞模型，通过加入阿糖胞苷，可有效地抑制胶质细胞的生长，保证神经元的纯度，经台盼蓝染色检查，细胞存活率达97％，符合细胞培养实验的要求。在脑低氧损伤机制的研究中， 目前最受重视的是兴奋性氨基酸毒性作用及胞内钙超载学说。低氧引起突触前兴奋性氨基酸大量释放，过度激活突触后电压依赖性NMDA受体门控通道，引起细胞外Ca2+大量内流，导致细胞内Ca2+超载，干扰线粒体的氧化磷酸化过程；细胞浆Ca2+浓度升高被认为是凋亡的第二信使，它可以激活某些蛋白酶、内源性核酸酶和磷脂酶，这些酶的激活使细胞核结构受到破坏，从而造成神经元损伤。因此，细胞内Ca2+超载被认为是神经元低氧损伤的最后通路［8］。有研究表明，神经元凋亡产生的可能机制与Ca2+超载有关，细胞内Ca2+浓度升高是细胞凋亡的始动因素，反之，如能阻止细胞内Ca2+浓度升高，则能减慢和抑制细胞凋亡［9］。本实验结果表明，低氧造成细胞凋亡，引起Ca2+内流，细胞内Ca2+超载；而尼莫地平和Rg2可以减少Ca2+内流，抑制细胞凋亡，以0.050 mmol/L Rg2组作用最为明显。由于Fura2/AM与胞浆中的Ca2+有很高的亲和力，两者以1∶1结合形成Fura2Ca2+复合物。这一复合物的激发光谱高峰分别为380 nm和340 nm，且其发射光的荧光比值变化与Ca2+浓度成比例关系。因此，Ca2+浓度在10-3~10-5 μmol/L时荧光发射强度与Ca2+浓度之间存在一定的函数关系［7］。本实验结果显示，对照组Ca2+浓度明显高于其他3组。由此可见，低氧损伤了神经元，导致细胞内Ca2+超载，细胞内Ca2+显著增加。而Rg2可抑制Ca2+内流，有效地降低细胞内Ca2+含量。提示，Rg2可能通过抑制Ca2+内流来保护神经细胞抗低氧的损伤。
［参考文献］
［1］ZENG Y S, XU Z C. Coexistence of necrosis and apoptosis in rat hippocampus following transient forebrain ischemia［J］. Neurosci Res, 2000, 37(2):113.
［2］NITAHARA J, CHENG W, LIU Y. Intracellular Calium, DNase activity and myocyte apoptosis in aging Fischer 344 rats［J］. J Mol Cell Cardiol, 1998, 30(3):519.
［3］CHENG C, FASS D M, REYNOLDS I J. Emergence of excitotoxicity in cultured forebrain neurons coincides with larger glutamatestimulated ［Ca2+］i increases and NMDA receptor mRNA levels［J］. Brain Res, 1999, 849(1/2):97.
［4］江岩, 刘伟, 王晓明, 等.人参三醇皂苷对培养心肌细胞的钙通道阻滞作用和抗自由基作用［J］. 中国药理学报, 1996,17(2):138.
［5］杜怡峰, 张晨. 新生大鼠海马神经细胞原代培养方法的改良［J］.青岛大学医学院学报,2002,38(1)：55.
［6］谈冶雄, 李万亥, 陶学斌. 一种低氧条件下的神经元培养方法［J］. 第二军医大学学报,1997,18(2):181.
［7］文宝书,张敏,张乐之,等.应用Fura2/AM和Sulphinpyrazone测定大鼠海马细胞胞浆游离Ca2+浓度［J］.四川生理科学杂志,1997,19（2）：1.
［8］CHOI D W. Calciummediated neurotoxicity:relationship to specific channel types and role in ischemic damage［J］. Trends Neural, 1988,11(10):465.
［9］NICOTERA P, ZHIVOTOVSKY B, ORRENIUS S. Nuclear calcium transport and the role of calcium in apoptosis［J］. Cell Calcium, 1994,16(4):279.
