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【关键词】 线栓
［摘要］ 目的 探讨影响线栓法制作兔大脑中动脉闭塞（MCAO）再灌注模型成功率的因素及其解决方法。方法 成年健康新西兰兔103只，随机分为A组53和B组50只，每组再按体质量大小分3个亚组，A组应用同一标准头径的线栓，B组对应体质量不同而分别使用不同头径的线栓，比较A、B两组制作缺血再灌注模型的成功率。不成功的动物模型开颅取脑观察，并分析失败原因及其影响因素。结果 A组成功率（49.1%）明显低于B组（74.0％），差异有显著性（χ2=11.59，P<0.01）；46只不成功缺血再灌注模型中，插线过深者26只，占56.5%；插线深度不足者20只，占43.5%。结论 针对动物不同的体质量而选择相应大小头径的线栓，可获得较高的缺血再灌注模型制作成功率；插线过深及深度不足为缺血再灌注模型制作失败的主要原因。
［关键词］ 脑缺血；再灌注损伤；兔；动物模型
［ABSTRACT］Objective To investigate what affected the success rate in making focal cerebral ischemia and reperfusion by intraluminal thread technique in rabbits. MethodsNew Zealand white rabbits, 103, were randomly pided into two groups: A （53） and B （50）. Both A and B were pided into subgroups by weight of rabbits. In A groups, a same diameter of thread tip was used; in B groups, different diameter of thread tip was used based of weight. The success rate of making the models was compared between groups A and B. Unsuccessful models were observed for the reasons. ResultsThe success rate was lower in group A (49.1％) than in group B (74.0％) （χ2=11.59，P<0.01）. Among 46 unsuccessful models, 26 were due to overinsertion of the thread (56.5％), 20 were insufficientinserting (43.5％). ConclusionBy choosing appropriate thread according to different weights, the success rate can be improved in making ischemia models. Over or insufficient insertion of the thread are common reasons for the failure in models.
［KEY WORDS］cerebral ischemia; reperfusion injury; rabbits; animal model
随着功能磁共振成像如弥散加权成像（DWI）、灌注加权成像（PWI）、磁共振波谱成像（MRS）等新技术的迅速发展，可从影像学上对急性缺血性脑卒中的血流动力学、缺血区分子扩散及代谢情况进行较详细的描述。建立操作简便、稳定、可靠、重复性好的局灶性脑缺血再灌注动物模型，是进行这些研究的实验基础。目前，线栓法制作大脑中动脉闭塞再灌注（MCAOR）模型方法已被广泛而成功地应用于大鼠，而在制作兔MCAO模型的应用中仍相对较少［1~6］，仍然存在一些问题。本研究旨在探讨影响线栓法制作兔MCAOR模型成功率的因素及解决方法。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
选择新西兰兔103只，雌雄不限，体质量1.8~3.3 kg，健康状况良好，由山东省农业科学院实验动物中心提供。随机分为A组53只，B组50只。A组按体质量大小分为A1组13只，1.8~2.3 kg；A2组31只，2.4~2.8 kg；A3组9只，2.9~3.3 kg。A组动物均使用标准头径（0.51～0.55 mm）的线栓。B组亦按其体质量大小分为B1组12只，1.8~2.3 kg；B2组29只，2.4~2.8 kg；B3组9只，2.9~3.3 kg。B3~B3组按体质量大小分别对应使用不同头径的线栓，B1组0.46~0.50 mm，B2组0.51~0.55 mm，B3组0.56~0.60 mm。
1.2 线栓制作
将3号尼龙线（直径0.285 mm）剪成10 cm长的线段，在距线段的一端0.5~1.0 cm处，均匀涂上硅橡胶，直到线栓头端直径及形态达到所需要求，并在距离线栓头端6.0 cm处做标记。线栓头端直径用千分尺测量并控制在0.45~0.60 mm范围内，根据文献将0.51~0.55 mm作为标准线栓头径［7］。制备线栓应在实验前2~3 d进行，以保证线栓在使用前能充分晾干固定。
1.3 模型制作
动物称质量后，自耳缘静脉缓慢注射20 g/L的乌拉坦（5 mL/kg体质量）麻醉，常规消毒，无菌操作，颈部正中切口，充分暴露左侧颈总动脉（CCA）及颈动脉分叉，并向头侧小心分离出近段颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。在ECA发出第一分支前结扎ECA，动脉夹暂时夹闭CCA和ICA，于ECA结扎处的近端将其剪断，用镊子钳住其残端并将其反折使之与ICA方向一致。将线栓经ECA残端向ICA内缓缓送入，遇到ICA上的动脉夹时则松开动脉夹继续插线。当线栓进入ICA超过4.0 cm且有轻微阻力感不能进线时应停止插线，记录线栓插入深度，并将ECA残端及线栓一同结扎固定，记录时间作为动脉阻塞开始时间［7］。再灌注时，用镊子或血管钳夹住线栓外露残端轻轻向外拉出，直至遇到明显阻力感不能继续时停止牵拉，记录时间作为再灌注开始时间。
1.4 MR检查
采用GE Signa 1.5 T的MR扫描仪，标准头线圈，动物仰卧位置于头线圈中央，在定位相上取视交叉平面为中心层面，行冠状位连续扫描5层，层厚3 mm，层间距1 mm。扫描序列应用DWI。DWI扫描参数：TR 7 000 ms，TE 84 ms，FOV 14 cm×14 cm，矩阵128×128，在x、y、z轴3个方向分别施加扩散敏感梯度（b值取0和1 000 s/mm2）。
1.5 模型成功的标准
动物在完成插线后1 h行MR检查，DWI像上出现片状高信号区者为模型成功的标准。未成功的实验动物，在完成所需检查或死亡后开颅取脑观察，寻找不成功或死亡原因。
1.6 统计学处理
用Excel表格录入数据，SPSS 11.5统计学处理软件进行χ2检验。
2 结 果
2.1 动物模型的成功率
A组53只，缺血再灌注模型成功26只，总成功率为49.1%。其中A1、A2和A3组分别成功4、20和2只，成功率分别为30.8%、64.5%和22.2%。B组50只，缺血再灌注模型成功者37只，总成功率为74.0%。其中B1、B2和B3组分别成功9、22和6只，成功率分别为75.0%、75.9%和66.7%。A组成功率明显低于B组（χ2=11.59，P<0.01）。A组中A2组成功率最高，与A1、A3组之间均有显著性差异（χ2=4.207、5.041,P<0.05），而A1组与A3组成功率比较无显著性差异（P>0.05）。B组各组成功率均高于A组，而B1～B3组之间成功率无显著性差异（P>0.05）。
2.2 动物模型未成功的原因
未成功模型46只，其中未完成插线而死亡者8只，完成插线但未成功者38只。开颅取脑发现：26只系线栓插入过深穿破动脉血管壁，造成不同程度的蛛网膜下隙出血，其中7只伴有脑实质内局部血肿，从而导致动物死亡或DWI像上未见异常信号或显示为局部低信号，占56.5%；20只系线栓插入深度不足，其中8只系线栓未插入颅内，12只系线栓已入颅但未阻塞MCA，占43.5％。
3 讨 论
大脑中动脉（MCA）是人类缺血性卒中的好发部位。兔的颅内主要供血动脉为ICA，颅内外血管间吻合网少，脑内血管分支间的端端吻合发达程度与人脑类似，且兔MCA主干阻断后，其他侧支循环对MCA供血区脑组织的代偿性供血作用很小，这些特点均有利于建立重复、稳定的缺血性病灶。国内外已有制作兔脑MCAO再灌注模型的研究，但关于如何提高模型制作成功率的研究较少［8~10］。
MOLNAR等［4］最早建立了不开颅法制作兔MCAO再灌注模型，开始将一直径0.40~0.45 mm的银球焊接到一细线上，后来又将线栓换成了连接在细弹性纤维上的胶球。NABAVI等［5］使用5号尼龙丝线，线栓头端涂硅橡胶。一根理想的硅橡胶线栓，其头端除了要达到所需头径（粗度）外，作为硅橡胶载体的尼龙丝线要有足够的硬度及柔韧度，才能保证插线时既有一定的力度又不至于打弯。本研究中采用3号尼龙线，直径为0.285 mm，其硬度及柔韧度均能满足插线的要求。注意涂硅橡胶一定要均匀，而且要分数次涂，一般需要涂2~3次，使头端表面光滑无隆起而且有足够的圆钝度，才能保证顺利地进线；若头端过于粗糙，不但会损伤血管内膜， 1期刘学军，孔令琦，隋庆兰，等线栓法建立兔局灶性脑缺血再灌注模型研究39而且有可能影响操作者对阻力感的把握，难以控制进线深度。而线栓头端具有足够的圆钝度能使线栓在血管内行进（尤其是遇到分支或返折处）中不易穿破血管壁。线栓制作完成后应在距头端6 cm处作一标记，便于插线时控制并计算进线深度。孔令琦等［7］在兔脑MCAO模型及颈动脉系统血管铸型的研究中发现，体质量在2.5~3.0 kg的新西兰兔MCA内径在0.50 cm左右，左右侧无显著性差别。影响动物模型成功率的关键因素是线栓头端的直径以及线栓插入颈内动脉的深度，线栓由颈内动脉进入MCA起始部需要插线约50 mm，将线栓头径控制在0.51~0.55 mm可明显提高模型制作的成功率。本研究显示，用0.51~0.55 mm头径线栓，体质量在2.4~2.8 kg的动物插线成功率最高，但体质量过大或过小时成功率均较低。针对不同体质量的动物选择相应大小头径的线栓亦可获得较为理想的插线成功率。线栓头端能否顺利到达并阻塞兔MCA是缺血再灌注模型制作成功与否的关键因素，其影响因素有线栓头径进线深度和进线方向：插线初始经常遇到线栓行进受阻、打弯而不能顺利插线的情况，可通过调整进线方向使线栓尽量保持与颈内动脉方向一致，大多数情况下可以得到解决。插线时一定要动作轻柔，幅度不应过大，每次行进以约5 mm为宜，根据线栓的6 cm标记处判断进线深度。当线栓进入颈内动脉超过4 cm时，速度应减慢，同时仔细感受有无阻力感存在，如遇到轻微的阻力感即应停止插线，一般情况下不要试图继续进线，因为本研究表明，即使是稍微加力的尝试也有可能使线栓穿破动脉壁，导致模型制作失败。当线栓穿破动脉壁时，操作者往往会感到一种轻微的突破感，同时阻力感消失。如果在整个插线过程中（进线已超过4 cm甚至6 cm）始终未遇到较为明显的阻力感，则极有可能线栓已经穿破动脉壁并进入脑实质内，造成大量蛛网膜下隙出血及局部脑内血肿。本研究中，有26只动物系插线过深（进线深度均超过54 mm）而导致缺血再灌注模型的制作失败，占不成功模型总数的54.2%，该结果足以说明在插线过程中根据对阻力感的把握来控制进线深度的重要性，同时说明如果进线深度超过54 mm，导致颅内出血可能性极大。在插线过程中，如果线栓于插入初始阶段（进线不足4 cm）即有明显的阻力感，经反复调整插线方向后仍不能继续进线，则一般有两种可能，一是线栓过粗，头端卡在颈内动脉入口处或动脉返折处。重新选择头径较小的线栓后再尝试插线，该情况一般可以解决；另一种可能是线栓进入枕动脉。本研究中，出现这两种情况者共有9只，开颅取脑结果发现线栓头端均位于颅外，其中有3只位于枕动脉内。对后一种情况的解决需要操作者熟悉颈内动脉的走行、分支及变异情况。SCREMIN等［8］报道，兔脑颈内动脉系统存在一定变异，大约有1/3的枕动脉起源于颈内动脉近段或远段。起源于近段者在插线前应尽量向头侧分离颈内动脉，充分暴露枕动脉后用动脉夹临时夹闭其起始部，待线栓头端通过后再放开；亦可利用颈内动脉与枕动脉走行方向不同的特点，控制、调整插线的方向，避免线栓头端进入枕动脉。这种变异类型并不影响缺血再灌注模型的制作结果。而对于枕动脉起源于远段者，由于枕动脉发出位置较深，多在接近入颅处分出，故难以用动脉夹处理，该变异类型不宜作脑缺血再灌注模型，最好放弃该动物。还有一种情况，就是尽管整个插线过程均正常，但最后影像学检查仍显示为插线不成功的动物模型，该情况在本研究中有12只，开颅取脑发现，线栓头端位置位于MCA内者5只，位于ICA远段者7只，线栓头端均未见穿破动脉壁，颅内均未见出血。不成功原因，头端位于MCA内者可能系线栓头径过细不能完全阻塞MCA造成的；而头端位于ICA远段者可能系线栓进线深度不足造成的。
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