[金纳多对RCS鼠视网膜色素变性神经元保护作用]第二神经元为视网膜

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【摘要】目的探讨金纳多（Ginaton，EGb761）对RCS大鼠视网膜色素变性神经元保护作用的机制。方法将出生后雄性RCS大鼠48只随机分为给药组和对照组。给药组大鼠从生后7 d开始腹腔注射金纳多，每3 d注射一次，剂量为100 mg/kg。对照组大鼠注射生理盐水，剂量相同。苏木精伊红染色和TUNEL检测观察EGb761对视网膜色素变性神经元的保护作用。应用免疫组织化学方法检测Caspase2蛋白的表达。结果给药组大鼠生后20和25 d，感光细胞的数目与对照组大鼠比较明显增加（t＝3.32、3.56,P<0.05）。给药组大鼠生后25 d TUNEL检测阳性细胞数目比对照组少，差异有统计学意义(t＝3.74,P<0.05)。生后25～40 d，给药组和对照组大鼠在节细胞层和内核层观察到Caspase2阳性染色。给药组大鼠生后20和25 d时内核层Caspase2阳性细胞数少于对照组（t＝2.87,P<0.05）。结论在RCS大鼠视网膜变性的早期，EGb761对神经元起保护作用，其作用机制可能与Caspase2蛋白的低表达有关。

【关键词】视网膜炎色素性金纳多细胞凋亡 Caspase2蛋白大鼠

［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the protective mechanisms of Ginaton (EGb761) on hereditary retinal dystrophy in RCS rats.MethodsA total of 48 male RCS rats were randomly pided into treated and control groups. EGb761 100 mg/kg was injected intraperitoneally, once every three days in treated group， starting from seven days after birth； saline was given to the controls, dose and medication being the same as the treated group. The protective effect of EGb761 against retinal dystrophy was assessed by HE staining and TUNEL. The expression of Caspase2 was detected by immunohistochemistry. ResultsThe number of photoreceptor in the treated group was more than that in the controls at 20 and 25 days after birth （t＝3.32,3.56;P<0.05）. Twentyfive days after birth, the number of TUNELpositive cells of the treated group was obviously less than that of the controls (t＝3.74,P<0.05). From 25 to 40 days after birth, the Caspase2positive cells were seen in the ganglion cell layer and inner nuclear layer in both treated and control groups. The number of positive cells in the inner nuclear layer of treated group was less than that of the control group （t＝2.87,P<0.05）. ConclusionEGb761 has a protective effect on the early stage of retinal degeneration of RCS rats, its mechanisms may be related to the low expression of Caspase2.

［KEY WORDS］retinitis pigmentosa; EGb761; apoptosis; Caspase2 protein; rats

视网膜色素变性是一种眼科十分常见的致盲性疾病，到目前为止，其发病机制尚不清楚，亦无有效的防治办法。1938年，BOURNE等［1］首次报道了自发性蜕变的鼠种——RCS(Royal College of Surgeons)大鼠，人们基于这一动物模型进行了大量研究。RCS大鼠主要表现为视网膜色素上皮（RPE）不能有效吞噬感光细胞外节脱落的膜盘，致使膜盘堆积，感光细胞变性［2］。随着凋亡概念的提出，1994年TSO等［2］认为RCS大鼠感光细胞变性是通过凋亡的途径实现的。金纳多（Ginaton，EGb761）是从银杏叶中提取的复合物，可以增加脑血管的血流量，保护脑细胞，清除有害的氧化自由基，并有显著的抗凋亡作用［3］。本实验从感光细胞开始凋亡时观察EGb761对神经元的保护作用，并探讨EGb761的作用机制，为临床上日益增多的视网膜色素变性疾病的治疗提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 组织来源

出生后雄性RCS大鼠48只，随机分为给药组和对照组。12 h光照12 h黑暗循环条件下饲养，自由饮食、饮水。给药组大鼠从生后7 d开始腹腔注射EGb761，每3 d注射一次，剂量为100 mg/kg。对照组大鼠从生后7 d开始腹腔注射同剂量生理盐水。两组大鼠分别在生后15、20、25、30、35、40 d处死，取其视网膜组织，观察EGb761对感光细胞的保护作用。

1.2 标本制作

水合氯醛（400 mg/kg）腹腔麻醉动物后，取出眼球，冲洗后立即放入40 g/L多聚甲醛中固定6 h，去眼前节及玻璃体，依次放入100 g/L蔗糖中2 h，200 g/L蔗糖中2 h，300 g/L蔗糖中过夜。用OCT包埋剂填满眼球,沿眼球矢状面作连续冷冻切片，厚度5 μｍ，依次行苏木精伊红、TUNEL、Caspase2染色。

1.3 检测方法

原位细胞凋亡检测和Caspase2免疫组化检测均按常规操作。原位细胞凋亡检测阴性对照切片不加末端核糖核酸转移酶，阳性对照切片在反应前先用DNA酶Ⅰ消化。Caspase2免疫组化检测阴性对照切片不加一抗。

1.4 结果判定

采用激光共聚焦显微镜（OLYMPUS,IX81）获得数值显微图像。用8比特1 024×1 024像素的20倍放大的显微图像。TUNEL阳性表达为细胞核呈绿色荧光，测量视网膜每100 μｍ长视野内阳性细胞数。Caspase2阳性表达为细胞膜或胞浆呈黄色或棕黄色染色。每张切片取4个视野，用光学显微镜在200倍视野下观察，计数每100 μm长视野内阳性细胞数。

2 结果

2.1 苏木精伊红染色

2.1.1 对照组大鼠生后15 d视网膜还未发育成熟。20 d时，视杆层厚度增加，内节变窄，外节增厚，有排列紊乱及空泡现象。25 d时，感光细胞数目有所下降。30 d时，感光细胞染色加深，其数目减少，外节形态不规则，内节明显变窄。35 d时感光细胞数目与30 d相比明显减少。40 d时，感光细胞数目与35 d相比明显减少，视网膜色素上皮细胞可见排列紊乱，体积增大，外形不规则。60 d时，仅有少许感光细胞存在，平均细胞计数为（9.80±2.59）个。内核层（INL）细胞、神经节细胞形态和数目基本正常。

2.1.2 给药组大鼠生后15 d，外核层（ONL）感光细胞数目与对照组大鼠相比无明显差别（t＝1.36，P>0.05）。20 d时，感光细胞数目比对照组细胞数目多（t＝3.32,P<0.05）。25 d时，给药组大鼠感光细胞数目较20 d时有所下降，但与对照组相比明显增加（t＝3.56,P<0.05）。见表1。

2.2 TUNEL检测

对照组大鼠生后25 d，ONL可以观察到少许TUNEL反应阳性的细胞核。30 d时，TUNEL反应阳性细胞核数目明显增加。35 d时阳性细胞核数目最多。40 d时，阳性细胞核数目较35 d时减少。给药组大鼠生后25 d，ONL也可以观察到TUNEL反应阳性的细胞核，阳性细胞计数与对照组相比，差异有统计学意义(t＝3.74,P<0.05)。其余时间段无明显差异。见表2。

2.3 Caspase2检测

生后20～40 d，给药组和对照组大鼠在节细胞层和INL观察到Caspase2阳性染色。给药组大鼠在20 d和25 d时INL的Caspase2阳性细胞数多于对照组（t＝2.87,P<0.05），其余各时间段差异无显著性。给药组、对照组大鼠INL的Caspase2染色阳性细胞均在生后35 d达到高峰。见表3。表1 两组不同日龄大鼠视网膜每30 μm长视野内ONL感光细胞数目的变化表2 两组不同日龄大鼠视网膜每100 μm长视野内TUNEL检测阳性细胞数表3 两组不同日龄大鼠视网膜每100 μm长视野内INL的Caspase2阳性细胞数 3 讨论

EGb761俗称银杏黄酮，主要含黄酮甙、萜内酯、白果内酯。自从被发现以来临床上广泛用于治疗脑部、外周等血液循环障碍。然而近年来许多研究表明,EGb761在缺血、低氧以及非自然原因凋亡所致损伤的保护作用中发挥着重要作用。有研究证实,EGb761对羟自由基诱导的大鼠脑神经细胞的凋亡有抑制作用［4］。BEHARCOHEN等［5］的实验证实了NO参与了亚硝酸盐细胞毒性对培养的牛视网膜色素上皮细胞的作用，EGb761作为一种自由基清除剂可保护视网膜色素上皮细胞免受亚硝酸盐细胞毒性的损伤。EGb761还可以延缓白内障动物模型中眼球混浊的进程，可能有抗白内障的有益作用。FIES等［6］发现EGb761对老年黄斑变性导致的视力受损有治疗作用。这些均为EGb761对遗传性视网膜色素变性可能的治疗作用提供了依据。

自从首次报道RCS大鼠以来，人们对这一动物模型视网膜色素变性导致感光细胞凋亡的机制进行了大量研究。刘斌等［7］报道，RCS大鼠出生后25 d时，视网膜PRC内节处偶见有P53阳性染色，30 d时PRC胞质内有明显的阳性染色颗粒，主要位于内节，外节处为阴性，少许PRC细胞核呈阳性染色。RCS大鼠出生后30 d P53蛋白呈强阳性，提示PRC的凋亡可能为P53依赖性。迟焕芳等［8］研究显示,RCS大鼠视网膜变性过程中bcl2原癌基因可能不参与感光细胞的保护机制。目前对视网膜色素变性的治疗方法主要有基因治疗、感光细胞移植、药物干预。前两种方法因目前尚难解决的一些技术问题使其应用受到很大限制，而药物干预则通过影响视网膜色素变性形成过程中一些代谢变化而显示了良好的应用前景。本实验中我们观察到,给药组大鼠在生后20、25 d外核层感光细胞的数目比对照组多（P<0.05），提示EGb761在RCS大鼠感光细胞变性的早期对感光细胞有保护作用。但研究结果还表明，RCS大鼠出生25 d以后，给药组和对照组视网膜感光细胞存留数目的差别无显著性，这可能是由于RCS大鼠生后25 d感光细胞发生凋亡，35 d是感光细胞凋亡的高峰期。TUNEL检测表明，给药组大鼠视网膜在25 d时凋亡的细胞数比对照组减少（P<0.05），余时间段两者差异无显著意义。本实验结果提示，EGb761对感光细胞早期凋亡有抑制作用。

Caspase即半胱氨酸天冬氨酸酶，通常以无活性的蛋白酶原形式在细胞内合成和分泌。在放射线、氧化损伤、缺血低氧等诱导凋亡信号的刺激下，酶原形成四聚体而活化，形成Caspase活化级联反应。Caspase一经激活裂解其作用底物，细胞凋亡便不可逆地进入实施阶段，并以细胞解体、凋亡小体形成而告终。Caspases2检测显示,生后25～40 d，给药组和对照组大鼠在节细胞层和INL观察到Caspase2阳性染色。给药组在20、25 d时INL的Caspase2阳性细胞数少于对照组（P<0.05）。给药组和对照组INL Caspase2阳性细胞数均在35 d达到高峰，其趋势与TUNEL检测相一致。结果提示，EGb761对凋亡抑制作用可能与抑制Caspase2蛋白的表达有关。

视网膜色素变性是一种发病年龄早、病程进展慢、对视力影响大的遗传性致盲眼病。多种突变基因干扰了感光细胞内光电转化反应和能量代谢，并通过不同途径，激活视网膜色素上皮细胞及感光细胞内程序化死亡过程。但迄今为止，视网膜色素变性一直没有有效的药物治疗。本实验在RCS大鼠不同鼠龄段注射EGb761，通过TUNEL及凋亡相关因子检测，结果显示EGb761能抑制感光细胞早期神经元的凋亡。EGb761对神经元具有保护作用，临床应用较为安全，因此，将来或许可以把EGb761作为视网膜色素变性的治疗药物之一。

【参考文献】

［1］BOURNE M C, CAMPBELL D A, TANSLEY K. Hereditary degeneration of rat retina［J］. Ophthalmol, 1938, 22: 613623.

［2］ TSO M O, ZHANG C, ABLER A S, et al. Apoptosis leads to photoreceptor degeneration in inherited retinal dystrophy of RCS rats［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1994,35(6):26932699.

［3］ SMITH J V, BURDICK A J, GOLIK P, et al. Antiapoptotic properties of Ginkgo biloba extract EGb761 in differentiated PC12 cells［J］. Cell Mol Biol (Noisylegrand), 2002, 48(6):699707.

［4］ NI Y, ZHAO B. Preventive effect of Ginkgo biloba extract on apoptosis in rat cerebellar neuronal cells induced by hydroxyl radicals［J］. Neurosci Lett, 1996,214(2/3):115118.

［5］ BEHARCOHEN F F, HEYDOLPH S. Peroxynitrite cytotoxicity on bovine retinal pigmented epithelial cells in culture［J］. Biochem Biophys Res Commun, 1996,226(3):842849.

［6］ FIES P, DIENEL A. Ginkgo extract in impaired vision——treatment with special extract EGb761 of impaired vision due to dry senile macular degeneration ［J］. Wien Med Wochenschr, 2002,152(15/16):423426.

［7］刘斌,朱秀安. 遗传性视网膜变性感光细胞凋亡与P53蛋白表达［J］. 北京医科大学学报, 1998,30(2):110112.

［8］迟焕芳,乔淑红,曹文强. RCS大鼠感光细胞凋亡与Bcl2蛋白表达［J］. 青岛大学医学院学报, 2003,39:123126.