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  • 您的位置:写论文网 > 管理学 > 旅游管理论文 > 大鼠缺血再灌注 胡黄连对缺... 正文 2019-08-19 19:24:51

    大鼠缺血再灌注 胡黄连对缺血再灌注大鼠脑内NMDAR1 mRNA表达的影响

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    【关键词】 缺血

    [摘要] 目的 观察缺血再灌注模型大鼠脑内N甲基D天门冬氨酸受体1(NMDAR1)mRNA的变化,探讨胡黄连对神经元的保护作用。方法 参照线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型,胡黄连干预,原位杂交方法观察皮质、纹状体NMDAR1 mRNA表达。结果 对照组缺血侧皮质区、纹状体区于缺血再灌注1 d时NMDAR1 mRNA表达达高峰,7 d后逐渐下降,但各时间点与假手术组比较,均有显著性差异F=3.6、.2,q=11.4~16.7,P<0.01);胡黄连治疗组大鼠脑皮质与纹状体NMDAR1 mRNA基本接近假手术组,明显低于对照组(t=9.43~10.55,P<0.01)。结论 胡黄连对脑缺血再灌注损伤神经元有一定保护作用,其机制可能与下调脑内NMDAR1 mRNA表达有关。

    [关键词] 胡黄连;脑缺血;N甲基D天门冬氨酸受体1;大鼠,Wistar

    [ABSTRACT]ObjectiveTo observe the expression of NmethylDaspartate receptor 1 (NMDAR1) mRNA following cerebral ischemic reperfusion in rat brain, and to investigate neuroprotective effects of picrorhizae on neurons. MethodsThe cerebralschemicreperfusion models in rat were made by intraluminalthread method and interfered by picrorhizae. The expression of NMDAR1 mRNA in cortex and striatum were determined with in situ hybridization. ResultsIn the control group, the expression of NMDAR1 mRNA peaked at one day on ischemic cortex and striatum and descended gradually after seven days. Compared with shamoperation group, there was significant difference at each time point (F=3.6,7.2;q=11.4-16.7;P<0.01). In the cortex and striatum of picrorhizaetreated group, the expression of NMDAR1 mRNA positive neurons was close to that of the shamoperation group, but significantly lower than in the control group (t=9.43-10.55, P<0.01). ConclusionPicrorhizae could protect the neurons from ischemicreperfusion injury by decreasing the expression of NMDAR1 mRNA in the brain.

    [KEY WORDS]picrorhizae; cerebral ischemia; NmethylDaspartate receptor 1; rats, Wistar

    N甲基D天门冬氨酸受体(NMDAR)是中枢神经系统内一类重要的兴奋性氨基酸(EAAs)受体,广泛存在于中枢和外周神经系统[1]。脑缺血再灌注后,引起局部脑组织兴奋性氨基酸,尤其是谷氨酸和天门冬氨酸大量释放,可过度激活NMDA受体,从而介导兴奋性氨基酸的神经毒性作用,即通过NMDA受体激活电压门控Ca2+通道,促使Ca2+病理性内流增加,细胞内Ca2+的积聚导致神经元发生退行性改变和坏死[2,3],而NMDA受体拮抗剂对缺血性神经损伤有保护作用[2]。本实验通过观察胡黄连对脑缺血再灌注模型大鼠脑内NMDAR1 mRNA表达的影响,以探讨其对损伤神经元的保护机制。

    1 材料和方法

    1.1 实验动物和分组

    健康雄性Wistar大鼠36只,清洁级,由山东大学动物实验中心提供(合格证号:D20021236),3~4月龄,体质量(246±15)g。常规饲养,环境温度为22 ℃。随机分为对照组24只、治疗组8只和假手术组4只。应用改良线栓法[4],经左侧颈外颈内动脉插线建立大脑中动脉闭塞(MCAO)再灌注模型,模型成功的标志为动物苏醒后,出现左侧Horner征,提尾右前肢内收屈曲,爬行时右侧画圈。对照组又分为缺血1.5 h再灌注6 h、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d组,每组4只;治疗组又分为缺血1.5 h再灌注后14 d、21 d组;假手术组仅插入10 mm尼龙线,其余步骤同对照组。

    1.2 处理方法

    对照组:模型成功后即刻灌胃,每天以生理盐水灌胃1次,每次3 mL。假手术组:每天同步以生理盐水灌胃1次,每次3 mL。治疗组:每天同步以胡黄连甲醇提取物灌胃1次,每次3 mL。

    1.3 脑组织取材

    各组大鼠术后不同时间点用100 g/L戊巴比妥钠麻醉,暴露心脏,先以生理盐水200 mL经升主动脉冲洗,再以40 g/L多聚甲醛200 mL灌注固定,持续30 min后取脑组织备用。取材范围为前囟后2.0 mm至前囟前3.0 mm。脑组织常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋,连续冠状切片(片厚5 μm),粘于用多聚赖氨酸处理的切片上,室温保存备用。 1.4 原位杂交

    NMDAR1 mRNA原位杂交试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。按其说明书操作,标本切片,脱蜡,水化至水;依次滴加H2O2、胃蛋白酶、预杂交液、杂交液、生物素化鼠抗地高辛、SABC后,DAB显色,镜下根据细胞着色情况控制反应时间,双蒸水冲洗终止反应;常规脱水、透明、封片。光镜下观察,细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞。取部分切片不加探针以0.1 mol/L PBS代替,不出现阳性细胞,说明探针特异性强。

    1.5 统计学处理

    采用德国欧波同公司VIDAS图像分析系统,将标本的图像输入电脑,对阳性细胞作吸光度扫描,获得吸光度值。应用SPSS 10.0统计软件包进行分析。数据采用±s表示。组间比较采用方差分析和t检验。

    2 结 果

    假手术组脑组织皮质区和纹状体区NMDAR1 mRNA呈基础水平的表达,对照组缺血侧皮质区、纹状体区于缺血再灌注6 h后阳性细胞着色开始加深,1 d时达到高峰,以后表达逐渐减弱,但各时间点与假手术组比较,差异均有显著性(P<0.01);治疗组大鼠脑皮质与纹状体区NMDAR1 mRNA基本接近假手术组,但明显低于对照组(P<0.01)。见表1。

    3 讨 论

    NMDAR是中枢神经系统内一类重要的EAAs受体[1],由7种亚基构成,其中NMDAR1在NMDAR的激活中是必需成分,具有基本的NMDAR通道特

    表1 各组缺血侧皮质、纹状体区NMDAR1 mRNA的表达(略)

    NMDAR在脑缺血再灌注损伤中起重要作用,QUO等[6]利用放射自显影检测结果证实,大鼠在化学诱导局灶性脑缺血后,NMDAR表达水平上调,NMDAR结合位点增多。本实验采用大鼠脑缺血再灌注模型,结果显示,NMDAR1的表达在缺血再灌注后6 h开始上升,于1 d时达到高峰,后逐渐下降,但各时间点与假手术组比较均有显著上升,与有关报道相一致。脑缺血再灌注后,大量EAAs释放,NMDAR作为离子型EAAs受体,可与EAAs结合,激活受体门控Ca2+通道,引发Ca2+大量内流,同时缺血低氧后NMDAR被激活,可引起生长抑素及生长抑素mRNA含量增加[7],升高一氧化氮[8]、白细胞介素1、热休克蛋白70 mRNA、cfos mRNA等,致神经元损伤。胡黄连为我国传统中药,主要生物活性成分是环烯醚萜甙类化合物。LI等[9~11]发现,环烯醚萜甙类化合物有增强神经生长因子诱导PC12神经细胞轴突生长的作用。通过建立神经细胞自由基损伤模型,观察到胡黄连苷Ⅱ可提高细胞的存活率,减少乳酸脱氢酶的释放量,降低细胞内活性氧水平,对PC12神经细胞损伤具有明显的保护作用。本研究结果表明,胡黄连组缺血侧皮质区和纹状体区细胞NMDAR1 mRNA表达基本接近正常,而明显低于对照组,提示胡黄连有改善大鼠脑缺血再灌注后损伤神经元的功能,其作用机制可能与胡黄连下调脑内NMDARI mRNA表达有关,从而减轻兴奋性氨基酸的神经毒性,起到神经保护作用。

    [参考文献]

    [1]LAWAND N B, WILLIS W D, WESTHUND K N. Excitatory amino acid receptor involvement in peripheral nociceptive transmission in rats[J]. Eur J Pharmacol,1997,324(2/3):169177.

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