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  • 您的位置:写论文网 > 社会学论文 > 人口问题论文 > 什么是内皮细胞【牡蛎糖胺聚... 正文 2019-08-20 07:42:11

    什么是内皮细胞【牡蛎糖胺聚糖对H2O2所致血管内皮细胞氧化损伤的保护作用】

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    【摘要】 目的 了解牡蛎糖胺聚糖(OGAG)对过氧化氢所致血管内皮细胞(VECs)氧化损伤的保护作用及其机制。方法 采用人脐静脉内皮细胞株ECV304体外培养的方法,建立H2O2诱导的血管内皮细胞损伤模型,实验分为正常对照组、损伤模型组(过氧化氢50 mg/L)、肝素组(肝素200 mg/L,过氧化氢 50 mg/L)、OGAG保护组(OGAG 10、50、100、200、400、800 mg/L,过氧化氢 50 mg/L)、OGAG对照组(OGAG 100、200、400 mg/L)。采用噻唑蓝(MTT)比色法观察OGAG对血管内皮细胞增殖活性的影响,黄嘌呤氧化酶法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果 与正常对照组相比,损伤模型组细胞的增殖活性和SOD的活活性均明显降低(F=137.23、135.40,q=5.26、 5.34,P<0.01),而OGAG对照组(100、200 mg/L)的细胞增殖活性明显增高(q=3.40、3.81,P<0.05)。与损伤模型组相比,OGAG各保护组(50~800 mg/L)细胞增殖活性明显增加(q=3.40~5.23,P<0.05、0.01),SOD活性明显升高(q=4.46~5.07,P<0.01)。结论 OGAG对过氧化氢所致血管内皮细胞的氧化损伤具有保护作用,其作用机制可能与增加细胞内SOD活性有关。

    【关键词】 牡蛎糖胺聚糖 内皮细胞 过氧化氢 超氧化物歧化酶

    [ABSTRACT]ObjectiveTo assess the protective effect of oyster glycosaminoglycan (OGAG) on the injury of vascular endothelial cells (VECs) induced by hydrogen peroxide and its corresponding mechanism.MethodsThe endothelial cell strain from human umbilical vein was cultured and a model of VECs injured by hydrogen peroxide (H2O2) was established. This study was conducted as follows: normal control group, OGAG control group (OGAG 100, 200, and 400 mg/L), H2O2injury group (H2O2 50 mg/L), heparin group(heparin 200 mg/L,H2O2 50 mg/L) and OGAG protective group(OGAG 10, 50, 100, 200, 400, and 800 mg/L,H2O2 50 mg/L). Influence of OGAG on proliferate activity of VECs was tested by means of MTT assay and levels of SOD were tested by xanthine oxidase. ResultsCompared with the normal control group, the proliferate activity of VECs of OGAG control group was significantly increased (q=3.40,P<0.05), while the proliferate activity of VECs and the levels of SOD of H2O2injury group were markedly decreased (F=137.23,135.40;q=5.26,5.34;P<0.01). Compared with OGAG control group, the proliferate activity of VECs and levels of SOD of the OGAG protective group were more significantly increased (q=3.40-5.11;P<0.05,0.01).ConclusionOGAG can protect the VECs from H2O2induced injury, and the possible mechanism may refer to the increasing of SOD activity in the injured VECs.

    [KEY WORDS] oyster glycosaminoglycan; endothelial cells; hydrogen peroxide; superoxide dismutase

    牡蛎(Oyster)俗称蛎黄、海蛎,是近海生长的一种双壳贝类动物,其不仅肉味鲜美,而且也是传统的中药材,具有滋阴养血、清热除湿、止心脾气痛等功效[`1]。牡蛎肉中含有丰富的糖原、蛋白质、氨基酸、微量元素及维生素等,其提取物具有抗菌、抗病毒、提高免疫力、调节血脂、抗动脉粥样硬化等作用[2]。近年来研究发现,血管内皮细胞的功能异常容易导致高血压、动脉粥样硬化等多种心血管疾病的发生。本文采用体外细胞培养的方法,通过建立过氧化氢诱导的血管内皮细胞(VECs)损伤模型,观察牡蛎糖胺聚糖(OGAG)对损伤VECs的保护作用。现将结果报告如下。

    1 材料与方法

    1.1 材料及其来源

    OGAG,青岛大学医学院药理学教研室提供; DMEM培养基,美国Hyclone 公司;胎牛血清,中国医学科学院生物工程研究所;胰酶,美国华美生物工程公司;肝素,上海生化制药厂;H2O2,山东高密制药厂;噻唑蓝,Sigma公司;二甲亚砜,Amresco公司;超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒,南京建成生物研究所;酶标仪,英国Tecan公司;721B型紫外线分光光度计,上海第三分析仪器厂;人脐静脉内皮细胞株ECV304,用DMEM含高糖培养基(含体积分数0.10胎牛血清)在含体积分数0.05 CO2的细胞培养箱中,37 ℃常规培养,实验采用传代细胞。

    1.2 实验方法

    1.2.1 实验分组 实验共分12组:正常对照组(1组)、损伤模型组(2组,过氧化氢 50 mg/L)、肝素组(3组,肝素200 mg/L,过氧化氢 50 mg/L)、OGAG保护组(4、5、6、7、8、9组,OGAG浓度分别为10、50、100、200、400、800 mg/L,过氧化氢 50 mg/L)、OGAG对照组(10、11、12组,OGAG浓度依次为100、200、400 mg/L)。

    1.2.2 培养条件 将传代的VECs按108/L接种于96孔板,至汇合状态时, 换成无血清的DMEM培养基,同时肝素组、OGAG保护组和OGAG对照组分别加入相应浓度的药物给予处理,培养24 h后,损伤模型组、肝素组和OGAG保护组分别加入含H2O2(终浓度为50 mg/L)的培养基,12 h后终止培养。

    1.2.3 细胞增殖活性测定 采用MTT法。细胞终止培养后加入MTT 20 μL,继续孵育4 h后,每孔加入200 μL的二甲亚砜,振摇,置于酶标仪测定570 nm处各孔吸光度(A),分析细胞的增殖活性。

    1.2.4 SOD活性的测定 采用黄嘌呤氧化酶法:黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基,后者氧化羟胺形成亚硝酸盐,在显色剂作用下呈红色,分光光度计测其吸光度,计算被测样品中的SOD活性。

    1.3 统计学处理

    数据以±s表示,均数间比较采用方差分析。

    2 结 果

    2.1 OGAG对氧化损伤的VECs增殖活性的影响

    与正常对照组比较,损伤模型组VECs增殖活性明显降低(F=137.23,q=5.34,P<0.01),OGAG对照组(100、200 mg/L)细胞增殖活性明显增强(q=3.46、 3.81,P<0.05)。与损伤模型组比较,OGAG保护组(50~800 mg/L)细胞增殖活性均有所增高(q=3.40~ 5.23,P<0.01、 0.01),且随着OGAG浓度的增加,细胞增殖活性逐渐增强(图1、2)。

    2.2 OGAG对氧化损伤的VECs的SOD活性的影响

    正常对照组、损伤模型组、OGAG 50 mg/L保护组、OGAG 100 mg/L保护组、OGAG 200 mg/L保护组、肝素组SOD的活性分别为2.411±0.085、1.211±0.088、1.669±0.079、1.753±0.051、1.997±0.076、1.672±0.038 kU/L。与正常对照组比较,模型组细胞SOD的活性明显降低(F=135.40,q=5.26,P<0.01)。与损伤模型组比较,OGAG各浓度保护组(50、100、200 mg/L)随着浓度增高,SOD活性逐渐增强 (q=4.46~5.07,P<0.01),OGAG浓度在200 mg/L时的作用最显著(q=3.70、3.03,P<0.05),在50、100 mg/L 时,其作用效果与肝素相近(P>0.05)。

    3 讨 论

    MTT是一种淡黄色的四氮唑化合物,在活细胞线粒体呼吸链上琥珀酸脱氢酶的作用下,还原成一种蓝紫色结晶,该结晶可溶于二甲亚砜,根据酶标仪测定吸光度大小,可反映细胞的数量和活性[3]。

    H2O2是机体产生的活性氧,在过氧化条件下能分解成一系列复杂产物,如氧自由基。氧自由基可通过对生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤,引发机体细胞内脂质发生过氧化,膜结构破坏,膜通透性增加,以致于组织损伤、坏死[4],参与多种疾病的病理过程。本实验的结果表明,模型组VECs增殖活性降低,表明H2O2可以抑制VECs增殖,引起VECs的损伤,而经OGAG预处理的各组VECs的增殖活性较模型组明显增加,且随着剂量的增大逐渐增强,这说明OGAG可减轻H2O2对VECs的损伤,且这种作用存在一定的剂量依赖性。此作用可能对VECs损伤时的修复具有重要作用。另外,在正常的VECs生长过程中加入一定浓度的OGAG,细胞的增殖活性与对照组相比也有明显增加,在200 mg/L时作用最强。说明OGAG在一定剂量范围内,有促进VECs增殖的作用。

    机体在代谢过程中可产生一定量氧自由基,氧自由基在体内对生物大分子(脂肪蛋白质、核酸)具有损伤作用,可引起细胞及组织损伤、坏死,但在正常情况下机体可通过自由基清除系统将其迅速清除[5]。SOD就是机体自由基清除系统的成员之一,它能够特异性清除O-2,催化O2发生歧化反应产生H2O2,再在过氧化氢酶的作用下变成水,具有保护细胞DNA、蛋白质和细胞膜的功能[6],当其活性及含量降低时,机体抗氧化能力下降,自由基清除障碍,致使自由基在体内堆积,造成细胞损伤。本实验结果显示,模型组SOD活性明显低于对照组,说明过氧化氢产生的氧自由基可使血管内皮细胞SOD的活性下降。OGAG保护组SOD活性明显高于模型组,说明OGAG可增加细胞对氧自由基的清除能力,减轻细胞内氧自由基对细胞功能和结构的损伤,从而对血管内皮细胞产生保护作用。

    【参考文献】

    [1]王世华,于红霞,王淑娥,等. 牡蛎提取物对高血糖小鼠保护作用[J]. 中国公共卫生, 2006,22(1):8081.

    [2]刘赛,仲伟珍,张健,等. 牡蛎提取物对鹌鹑实验性动脉粥样硬化的抑制作用及机制[J]. 中国动脉硬化杂志, 2002,10(2):97100.

    [3]高永红,袁拯忠,牛福玲,等. 脑微血管内皮细胞体外缺血再灌注模型的建立及牛胆酸的保护作用[J]. 中国中药杂志, 2005,30(12):930932.

    [4]兰文军,郑筱祥. 山楂叶抽提物对人脐静脉内皮细胞中过氧化氢的清除作用[J]. 中草药, 2005,36(3):414416.

    [5]高静,杨兰泽. 消化性溃疡患者血中MDA、SOD及GSHPX的变化[J]. 中国实用中西医杂志, 2005,18(23):1781.

    [6]朱伟群,刘汉胜. 养阴清肺糖浆对烟雾引起的慢性支气管炎大鼠炎症细胞及SOD、MDA、NO的影响[J]. 中药材, 2006,29(3):279282.

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