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【摘要】目的 研究海蜇活性肽制备与抗肿瘤活性。方法 海蜇先经正交试验确定最佳酶解条件，然后将酶解物离心得到海蜇活性肽粗品。粗品经超滤、SephadexG-15凝胶层析、冷冻干燥纯化得到海蜇抗肿瘤活性肽，通过MTT法及Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞测定了其对肿瘤细胞体外增值的影响。结果 碱性蛋白酶在温度为55℃，料液比为1:2，加酶量为1000 U/g，时间为4h的酶解条件下对海蜇进行酶解，酶解液中的氨基氮含量为41.3mg/100ml。从海蜇中分离纯化得到活性肽，MTT法表明：其对肿瘤细胞的增殖有较强抑制作用，且抑制作用具有明显量效依赖关系；Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术显示该肽可诱导肿瘤细胞凋亡。结论 经碱性蛋白酶酶解制备的活性肽对肿瘤细胞有明显的抑制作用，并能诱导肿瘤细胞凋亡。
【关键词】海蜇 酶解 抗肿瘤活性 活性肽
【Abstract】Objective To purify the anti-tumor activity peptide from jellyfish (Rhopilem aesculentum). Methods: First, the orthogonal experiment was adopted to product the crude peptide from jellyfish. Then, crude product was isolated by ultrafiltration, SephadexG-15 gel chromatography and antitumor activity peptide was obtained at last. Last, MTT method and double-labeled flow cytometry Annexin V-FITC/PI was used to determined the antitumor activity of peptide. Results Using alkaline protease at a temperature of 55℃, with the water ratio of 1:2, enzyme amount of 1000 U / g, hydrolysis time was 4h to enzyme jellyfish, and the hydrolyzate amino nitrogen contented in the product is 41.3mg/100ml. Purified from the jellyfish in a variety of active peptides, MTT method showed that its effect on tumor cell proliferation was strongly inhibited and the inhibition has a significant dose dependent, and Annexin V-FITC/PI double-labeled flow cytometry induced apoptosis of the tumor cells and apoptosis in a dose-dependent. Conclusion The peptide from jellyfish hydrolysate could significantly restrain tumor cells multiplication and induce tumor cells apoptosis.
【Key words】jellyfish enzyme anti-tumor activity active peptides
海蜇( Rhopilem aesculentum)俗称“鮓鱼”，隶属于腔肠动物门(Coelentera)、钵水母纲(Scyphozoa)、根口水母目(Rhizostomeae)、根口水母科(Rhizostomatidae)，海蜇属(Rhopilema)的无缘膜动物。海蜇的蛋白占其干重的50％，其氨基酸成分种类繁多，必须氨基酸含量丰富。海蜇等海洋生物为了适应高盐、高压、低温、缺氧等极端的海洋生活环境，其蛋白质的氨基酸组成与序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，在种类和数量上也远远超过陆地蛋白资源。在种类繁多的海洋生物蛋白氨基酸序列中，潜在着许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解，就能释放出有活性的肽段。
抗肿瘤肽是一种具有抗肿瘤效果的生物活性肽（biologically active peptides,简称BAPP）。目前已从海绵、海鞘、海兔、海藻、海苔虫、鲨鱼、珊瑚以及海洋微生物中分离出2万余种天然产物,其中不少化合物显示出明显的抗肿瘤活性,一些化合物已被作为抗肿瘤候选药物进入了临床前或临床研究阶段[1-3]。但海蜇抗肿瘤活性肽的研究尚处于空白，对其深加工技术与理论也甚少有研究[4]。因此，本研究拟利用浙江沿海丰富的水产品资源，运用最新的蛋白质提取及纯化工艺，对海蜇蛋白进行深度研究和开发，生产出具有特殊功能的活性肽产品。同时对海洋经济发展也将起到积极的推动作用，也会对海蜇的高值化利用提供实验依据。
1 实验材料和试剂与仪器
1.1 材料与试剂
海蜇购自舟山市场，用温水浸泡洗涤以除去明矾和盐分并沥干，切成条状，于水中浸泡12h，取出沥干，放入DS-1高速组织捣拌机中捣碎匀浆，-20℃冷藏备用；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶购自北京亚太恒信生物科技有限公司；F12粉末培养基和MTT均购自美国SIGMA公司；Sephadex G-15购自上海如吉生物科技发展有限公司；二甲基亚砜购自美国AMRESCO公司。其余试剂均为分析纯。
1.2 主要仪器
BSA124S型电子天平购自德国Sartorius AG公司；DS-1型高速组织捣碎机购自上海标本模型厂；CF16RXII高速冷冻离心机购自日立 HITACHI公司； SSW型微电脑电热恒温槽购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；722S可见分光光度计购自上海恒平科学仪器有限公司；PHS-25C酸度计购自上海理达仪器厂，85-2恒温磁力搅拌器购自常州国华电器有限公司，ZHJH-C1209C型超净工作台购自上海智诚分析仪器制造有限公司；Forma 3111型CO2培养箱购自美国Thermo公司；倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司；酶标仪购自美国Bio-Rad公司。
2 实验方法
2.1 蛋白酶及酶解条件的确定
2.1.1 水解酶选取
将海蜇分别用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶在各自的酶解条件下对海蜇进行酶解，酶解条件见表1。水解一定时间后，加热至90～100℃灭酶15min，然后将水解液以6000r /min 离心25min取上清液。测定氨基氮含量，选取最佳酶。
表1 酶的适宜作用条件
2.1.2 氨基氮含量测定
氨基氮含量的测定采用甲醛滴定法[5]，取5.0ml酶解液，定容至100ml，取20ml酶解液稀释液置于烧杯中，加水60ml，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准液滴定至pH为8.2。加入10ml甲醛溶液混匀，再用0.05mol/L氢氧化钠溶液继续滴定至pH为9.2，记下消耗氢氧化钠标准液的毫升数，同时取水80ml做试剂空白试验。按下列公式计算氨基氮(ANN)含量：
X：为样品中氨基氮的含量（g/100 ml）；
V1：为测定用样品加入甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准液（ml）；
V2：为试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）；
V：为样品液取用量（ml）；
C：为氢氧化钠标准液的浓度（mol/L）；
0.014为氮的毫摩尔质量（g/mmol）。
2.1.3 单酶水解条件的优化
以酶解温度A(35℃、45℃、55℃)、料水比B(1:2、1:3、1:4)、加酶量C(600U/g、800U/g、1000 U/g)、时间D(3h、4h、5h)为因素，设计L9(34)正交实验, 同样使用甲醛滴定法测定氨基氮含量，通过实验数据最终确定最佳酶解条件。
2.2 分离、提纯、测定抗肿瘤肽活性
2.2.1 酶解液的初步分离
将最佳条件下得到的酶解液通过超滤膜,分别截取分子量为3KDa、5KDa、10KDa的3种膜进行超滤，得到4种不同分子量的酶解液，将各组分冷冻干燥为海蜇活性肽粉末。将其作为抗肿瘤的样品，初步确定各组分抗肿瘤肽的活性，然后对该最佳活性肽进行大规模的初步收集。
2.2.2 SephadexG-15凝胶层析
将SephadexG-15凝胶颗料装柱，完毕后用去离子水平衡，然后将选取组分海蜇酶解多肽粉末以去离水子溶解稀释作为样品上样，紫外分光光度计280nm下进行检测，以去离水3ml/min进行洗脱，并收集各主要洗脱峰，将洗脱后得到的各主要峰进行抗肿瘤实验，确定各主要峰的抗肿瘤作用。
2.2.3 细胞培养
选取人前列腺癌细胞PC-3，肺癌细胞H1299（原购自中科院上海细胞库，由本实验室传代保存），用含10%小牛血清的RPMI1640完全培养基于37℃，5% CO2培养箱中培养至对数生长期。
2.2.4 细胞增殖抑制率的测定
采用MTT法进行检测[6]，配制PBS溶液（PH值为7.2）和浓度分别为1mg/mL， 5mg/mL，10ml/mL，15mg/mL，20mg/mL的海蜇酶解溶液。取对数生长期的细胞制成悬液，接种至96孔板，每孔200μL，于5% CO2，37℃贴壁4h，然后分别加入不同浓度的海蜇酶解溶液，每个浓度设3个平行孔，同时设不加药对照组，置5% CO2，37℃培养箱中孵育48h，培养结束加MTT继续培养4h，吸弃MTT，置酶联免疫检测仪在490nm测吸光度，计算细胞增殖抑制指数（IR），按下列公式计算。
IR=[(对照组A值-加药组A值)/对照组A值]×100%
2.2.5 流式细胞仪分析细胞凋亡[7]
将海蜇肽分为1mg/ml，5mg/ml，10mg/ml，15mg/ml和20mg/ml共5个浓度组，细胞贴壁后,各浓度组作用24h后，消化细胞，吹打成单细胞悬液，计数细胞，使收集细胞总数1 ×106以上，PBS洗涤2次，单细胞悬液在室温下1400 r/ min离心5min后弃上清，按照Annexin-V-FITC 凋亡试剂盒提供的方法检测暴露在细胞表面的磷脂酰丝氨酸( PS)，进行细胞凋亡与死亡的检测。
3 结果
3.1 蛋白酶的选择
在适宜酶解条件下，经胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对海蜇进行酶解后，每100ml的酶解液中氨基氮的含量分别为14mg、32ml和63ml。由此可见，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果远低于碱性蛋白酶，因此本实验选择碱性蛋白酶进行单酶水解条件优化试验。
3.2 正交试验结果
碱性蛋白酶的正交实验结果如表2，由该表可知，碱性蛋白酶对海蛰进行酶解的影响因素顺序为：温度＞时间＞料水比＞加酶量，最适宜的水解条件为：A3B1C3D2，即温度为55℃，料水比为1:2，加酶量为1000 U/g，时间为4h时，对海蜇的水解程度最大，此时每100ml的水解液中的氨基氮含量为41.3mg。
表2 碱性蛋白酶正交试验
注：表中A列1、2、3分别表示温度为35℃、45℃、55℃，B列1、2、3分别表示料水比为1:2、1:3、1:4，C列1、2、3分别表示加酶量为600U/g、800U/g、1000 U/g， D列1、2、3分别表示时间为3h、4h、5h。
3.3 分离纯化
在最佳酶解条件下得到的海蜇酶解液经超滤后得到＞10KDa、5-10KDa、3-5KDa和<3KDa 共4种不同分子量的酶解液。将<3KDa的组分进一步的分离纯化，其通过SephadexG-15凝胶柱可得到3个组分，即峰1、峰2和峰3（图1）。
图1 海蜇蛋白肽的SephadexG-15凝胶过滤层析图谱
3.4 抗肿瘤活性测定
从MTT检测结果可知，凝胶层析后得到的3个峰均可抑制肿瘤细胞的增殖，其中峰2对肿瘤细胞的增值抑制作用最强，在1-20mg/ml范围内，时间均为24h，且随着蛋白浓度的提高，抑制作用不断增强，表明海蜇酶解多肽对肿瘤细胞的抑制作用呈现明显的量效依赖关系（图2～5）。
图5 海蜇SephadexG-15凝胶过滤活性肽（<3K）各组分对H1299细胞增殖抑制指数
3.5 Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞检测
本实验采用的双标记方法使用能特异性结合凋亡时外翻的细胞膜PS的AnnexinV作为探针，并利用碘化丙啶(PI)不能透过完整细胞膜的特点，可以将凋亡细胞、坏死细胞、损伤细胞与正常细胞区别开，其中AnnexinV单阳性细胞为凋亡细胞，AnnexinV与PI双阳性细胞为坏死细胞，双阴性细胞为活细胞[8]。
图7 Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞检测H1299细胞凋亡
从图6、图7观察，对照组细胞主要分布在第三象限(AnnexinV-PI-)，因操作等原因引起的机械性死亡细胞(AnnexinV+PI-)数量也非常恒定(<2%)，随着药物浓度的提高凋亡细胞(AnnexinⅤ+/PI-)数量相应增加，肿瘤细胞凋亡作用呈剂量依赖。同时AnnexinV+/PI+细胞也增加，说明细胞开始出现坏死。
4 讨论
海蜇的氨基酸成分种类齐全，必须氨基酸含量丰富。在种类繁多的氨基酸序列中，潜在着许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解，就能释放出有活性的肽段。本实验通过单酶水解试验及L9(34)正交试验，确定在胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶3种蛋白酶中碱性蛋白酶为海蜇蛋白质的较优水解酶，且在温度为55℃，水比为1:2，加酶量为1000 U/g，时间为4h的酶解条件下对海蜇进行酶解时，酶解效果最佳。
在抗肿瘤活性研究中，选择经典的MTT法实验探讨海蜇酶解多肽的体外抗肿瘤活性，显示出良好的体外抗肿瘤活性，且呈现明显的量效依赖关系，表明了海蜇酶解多肽的抗肿瘤作用良好，具有较佳的开发前景。同时采用Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测了海蜇酶解多肽对肿瘤细胞诱导凋亡情况，说明本实验所得到酶解多肽抗肿瘤的作用机制之一是诱导细胞凋亡。
参 考 文 献
[1]连炜,叶波平.海洋天然抗肿瘤活性产物的临床研究现状[J].药学进展，2009(05):204-210.
[2]马永全,于新,黄小红.海蜇的药用与食用价值研究进展[J].广东农业科学, 2009(09):153-156.
[3]徐国成,罗刚,邵营泽.海蛰的加工方法[J].北京水产,2003(02):24-25.
[4]黄小红,于新,马永全.海蛰蛋白质酶水解工艺优化研究[J].广东农业科学,2009(06):116-119.
[5]宁正祥主编.食品成分分析手册[M].北京:中国轻工业出版社,1998:119-121.
[6]赵嘉惠,张华屏,王春芳.MTT法在检测细胞增殖方面的探讨[J].山西医科大学学报,2007,38(3):262-263.
[7]何芬,马旭东,王梦月,秦孙星,王威,李晓波.粗吻海龙蛋白质组分体外抗肿瘤活性的研究[J].中国药学杂志,2008(12):903-905.
[8]焦志军,王文红,杨友.AnnexinⅤ-FITC/PI双标记流式细胞术检测结直肠癌细胞凋亡[J].江苏大学学报(医学版),2005(02):97-99.
