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80年代以来，人乳头瘤病毒(Human papillomavirus’HPV)的致癌作用备受关注[1～3]，多数学者认为HPV型别，E6E7区亚基因片段，HPV-DNA的整合状态与其致癌性相关[4～6]。本文采用聚合酶链反应(PCR)及原位杂交(ISH)对不同宫颈病变组织行HPV－DNA分型，应用抗增殖细胞核抗原(Proliferating Cell nuclear antigen’PCNA)的单克隆抗体PC10检测不同宫颈病变组织中的PCNA表达，以探讨HPV感染所引起的宫颈过度增殖性病变的形态学定位及与细胞增殖活性的关系。
1 材料与方法
1.1 资料来源
标本取自1993年1月～1995年12月本院妇科感染门诊及妇科病房。全部标本均经组织病理学确诊。
1.2 实验方法
1.2.1 PCR组共253例，取宫颈、阴道刮取物行HPV6、11、16、18型检测。慢性宫颈炎18例，假性湿疣57例，疣样病变48例，尖锐湿疣60例，CIN59例，其中，CINⅠ41例，CINⅡ～Ⅲ18例，宫颈癌11例。试剂盒购自医科院基础所。
1.2.2 ISH及PCNA组共78例，正常宫颈15例，慢性宫颈炎16例，CIN32例，其中CINⅠ20例，CINⅡ9例，CINⅢ3例，宫颈癌15例。HPV16、18型感染的ISH阳性细胞表现为宫颈上皮表面中层细胞核(图1)，特别是挖空细胞核为蓝紫色颗粒产物，密集，深染。胞浆内可见弥漫状淡着色(图2)。PCNA阳性产物位于细胞核内，呈棕黄色细颗粒(图3)，每例选10个高倍视野行PCNA阳性细胞计数，根据阳性细胞总数的比例分为3级：Ⅰ级(＋)为＜10％阳性细胞；Ⅱ级(＋＋)为10％～50％；Ⅲ级(＋＋＋)为＞50％。
2 结果
2.1 用PCR对不同宫颈病变进行HPV-DNA分型
253例中，HPV总阳性率为52.3％(132/253)，按慢性宫颈炎、假性湿疣、疣样病变、尖锐湿疣、CIN及宫颈癌顺序，HPV阳性率呈依次递增趋势，分别为16.7％，29.8％，37.5％，61.7％，79.7％及90.9％。不同宫颈病变中HPV分型不同，尖锐湿疣和CINⅠ组HPV6/11型阳性率分别为97.3％和93.5％，而在CINⅡ～Ⅲ及宫颈癌组占50％和40％，两组差别有显著性(P＜0.05)。HPV16、18型在尖锐湿疣和CINⅠ组分别为45.9％和35.5％，在CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌组分别为75％及90％，两组差别有显著性(P＜0.01)，说明低危的尖锐湿疣和CINⅠ以HPV6、11型感染为主。高危的CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌以HPV16、18型感染为主。
2.2 不同宫颈病变中HPV-DNA原位杂交观察
2.2.1 从慢性宫颈炎→CIN→宫颈癌随着宫颈病变逐渐加重，HPV杂交信号逐渐增强，阳性细胞由上皮层逐渐到棘层，分布由散在→簇状→弥漫状，与HE染色切片中挖空细胞的分布相一致，细胞核阳性着色也由浅变深逐渐增强。
2.2.2 78例宫颈不同病变原位杂交结果
正常宫颈、慢性宫颈炎分别与CIN及宫颈癌相比，差异有显著性(P＜0.01)，说明CIN和宫颈癌与HPV16、18型感染密切相关。
2.3 不同宫颈病变中PCNA表达
2.3.1 PCNA形态学观察PCNA阳性物质主要位于细胞核内，也有部分出现胞浆着色，在正常宫颈及慢性宫颈炎中，PCNA阳性细胞主要散在于上皮基底细胞层中，着色淡，棘细胞层及角化层无阳性细胞。CIN组则多见于基底细胞及棘细胞层中。细胞异型明显者着色深，挖空细胞呈PCNA阳性着色。宫颈癌组具有PCNA阳性物质的细胞数量多，着色深、呈片状分布，向棘细胞分化的大细胞和基底样细胞阳性着色多见。
2.3.2 不同宫颈病变中PCNA表达
2.3.3 CIN分级与PCNA表达强度的关系CINⅠ组PCNA呈阳性表达者13例，表达强度(＋)者10例(76.9％)’(＋＋)→(＋＋＋)者3例(23.1％);CINⅡ～Ⅲ组呈阳性表达者10例，(＋)者2例(20％)，(＋＋)→(＋＋＋)者8例(80％)，两组相比说明在CINⅡ～Ⅲ组中细胞增殖活性明显增强(P＜0.01)。
2.3.4 HPV感染与PCNA表达的关系用ISH检测32例CIN中，HPV(＋)20例，HPV(－)12例。HPV(＋)组PCNA表达者17例(85％)，HPV(－)组PCNA表达者6例(50％)，两组相比PCNA表达率有显著差异(P＜0.05)。
3 讨论
3.1 不同宫颈病变中HPV感染的特点及形态学观察
随着分子生物学技术的不断进展，对HPV检测水平的不断提高，HPV检出率因方法不同而异。文献报道[7～10]正常人群中HPV检出率为10％～40％。生殖道疣约65％～100％。CIN中为25％～80％，宫颈癌中可达90％以上。本文用两种方法检测HPV－DNA，结果显示宫颈病变从慢性宫颈炎→CIN→宫颈癌，HPV感染有增加趋势，宫颈尖锐湿疣及CINⅠ以HPV6/11型染感的，CINⅡ～Ⅲ和宫颈癌以HPV16、18型感染为主。用原位杂交对HPV16、18型感染的定位观察显示HPV16、18阳性杂交信号多位于鳞状上皮浅层，包括伴有角化不全的角质层，颗粒细胞层及棘细胞层，随着宫颈病变由炎症→CIN→宫颈癌的逐步加重，HPV16、18型阳性细胞数量逐渐增多，阳性细胞带增宽，分布由散在→灶性→整个上皮层着色，挖空细胞核及异型细胞核大多呈阳性反应。这结果表明HPV感染具有特定的组织学部位，它仅能在完全分化的鳞状上皮中复制，它的存活、复制与鳞状上皮细胞分化和基因表达密切相关，只有在鳞状上皮细胞上移至中、表层时，HPV的生长、复制、整合及组装等一系列繁殖过程才能完成，挖空细胞的出现，可能是病毒复制晚期鳞状细胞所发生的形态学改变。
3.2 不同宫颈病变中PCNA表达
增殖细胞核抗原(PCNA)又称周期蛋白，是近年发现的聚积在S期复制细胞核内的细胞周期依赖性蛋白[11]，当细胞进入增殖周期时，PCNA量发生明显变化，在G1晚期开始增加，S期达高峰，G2期开始下降，PCNA做为DNA聚合酶的附属蛋白直接参与细胞增殖过程中的DNA复制，其含量和表达反映了细胞的增殖活性[12]。
本文对不同宫颈病变组织行PCNA免疫组化研究结果显示：正常宫颈组织中PCNA表达率为6.6％；慢性宫颈炎为43.8％；CIN为71.9％；宫颈癌为86.6％，各组表达率均明显高于正常宫颈。PCNA形态学观察表明不同宫颈病变中，PCNA阳性细胞数量、着色及分布均明显不同。这表明随着宫颈病变程度加重，PCNA阳性细胞数量明显增多，处于S期细胞的比例增加，阳性细胞带由基底层向鳞状上皮表层推移。这提示癌前病变及癌组织中细胞增殖活性明显增高，尤其值得注意的是挖空细胞核多呈PCNA阳性，与ISH阳性杂交信号出现部位有一致性倾向。表明HPV感染与细胞的增殖活性有关，分析CIN组中HPV感染与PCNA表达的关系证实HPV(＋)组PCNA表达率明显高于HPV(－)组。这提示HPV感染可使宫颈上皮细胞获得较高的增殖活性，并可能通过促进细胞的过度增殖而致癌变。
将PCR、ISH和PCNA三种方法结合使用可达到对HPV感染病变进行病毒检测和分型，以及组织形态学定位的目的，同时可观察HPV感染细胞的增殖活性，有助于HPV致癌机理的研究。
