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克隆技术研究论文3000字
克隆技术研究论文3000字 随着现代科学技术的不断发展，克隆技术对整个社会的可持续发展产 生了举足轻重的作用。下面小编给大家分享克隆技术3000字论文，希望能对大家 有所帮助！ 克隆技术3000字论文篇一：《试谈利用TAIL―PCR技术克隆南极磷 虾胰蛋白酶基因》 摘要：目的 研究南极磷虾胰蛋白酶基因的全序列，为低温酶的基因 工程制备建立基础。方法 以南极磷虾基因组DNA为模板，利用特异性的巢式引 物和随机引物，通过交错式热不对称PCR (Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction， TAIL-PCR) 克隆南极磷虾胰蛋白酶基因序列，并进 行序列分析。结果 测序结果表明，南极磷虾胰蛋白酶基因序列全长961bp，其中 含有开放阅读框(ORF)长度为798bp，编码266个氨基酸。结论 本实验成功克隆了 南极磷虾胰蛋白酶基因，为进一步了解该酶的结构、功能和基因工程制备奠定了 基础。关键词：南极磷虾;TAIL-PCR;胰蛋白酶;基因 胰蛋白酶是动物消化系统中主要的一种碱性蛋白水解酶，属丝氨酸蛋 白酶家族，能专一性地水解肽链中赖氨酸和精氨酸的羧基所形成的肽键。南极磷 虾因其独特的生活环境，体内的胰蛋白酶具低温高效性，有研究表明，南极磷虾 胰蛋白酶在37℃和1～3℃时的活性分别是牛胰蛋白酶活性的12倍和60倍[1]。深 入研究该酶对适冷性酶酶学性质的探究、蛋白质工程体系的完善具有极高的价值。
目前获得南极磷虾胰蛋白酶的方法主要是组织提取，这不仅步骤繁琐而且成本高 昂。本文旨在克隆南极磷虾胰蛋白酶基因，为进一步在工程菌中表达以大量获得 南极磷虾低温酶奠定基础。
交错式热不对称PCR (Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction， TAIL-PCR)是一种快速有效扩增已知DNA序列侧翼未知序列的方法 [2-3]，由Liu和Whittier[4]首次报道该技术。目前许多基因的克隆都是通过这个方 法获得，马春骥等[5]用TAIL-PCR成功克隆了绵羊肺炎支原体Y98株的未知基因 Hsp70 (DnaK) ，张伟涛等[6]利用TAIL-PCR克隆了一种耐盐基因。1 材料与方法 1.1材料 南极磷虾冰冻样本2012年取自南冰洋水域48.1区，限制性核 酸内切酶BamHⅠ、EcoRⅤ、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、Genome Walking Kit购自Takala公司，pEASY-Blunt Cloning kit、pEASY-T1 Cloning Kit购自全式金 公司，TIANamp Marine Animals DNA Kit购自天根生化科技(北京)有限公司， DNA Engine Dyad PCR仪产自美国Bio-RAD公司，PCR引物由北京华大基因公司 合成。
1.2南极磷虾基因组DNA的提取 南极磷虾为本课题组参加南极科考 任务所取样品，取其尾节肌肉组织提取DNA，按照动物组织基因组DNA提取试 剂盒说明书进行基因组DNA提取。
1.3南极磷虾胰蛋白酶基因保守片段的克隆 根据文献及GenBank中已 报道同源性较高的几种甲壳动物胰蛋白酶的氨基酸序列，得到两条简并引物。上 游引物：CCTTACCAGCTCAGCTTCCAG;下游引物：
TGCGGTGTTAGTCATAATCC。使用上述简并引物对基因组DNA进行PCR扩增， 反应体系：template DNA 200ng，primer1 10pmol，primer2 10pmol，PrimeSTAR Max Premix (2X) 25μl，Sterilized distilled water to 50μl。反应条件：98℃ 10s，55℃ 5s， 72℃ 5s，35个循环，72℃延伸5min，扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，将 PCR产物用QuickGel Extraction Kit回收后克隆至pEASY-Blunt Cloning Vector，经 酶切鉴定重组质粒测序。
1.4利用TAIL-PCR获得基因5" 端序列 根据克隆得到的基因序列，利 用Primer5.0软件设计3条序列特异性的巢式引物，SP1：
GAGGAATGGCCTGGA CGAAGTCATT;SP2：CTCATGTTGGATGATCTTGGACAGG;SP3：
AACACAATG TCCAGCGCAGATGGC。进行TAIL-PCR时，分别用AP1 Primer和AP2 Primer进行反应，以AP2组为例，用上述提取的基因组DNA作为模板，以AP2 Primer作为上游引物，以SP1作为下游引物，进行1st PCR反应。2st PCR 反应将 1st PCR反应产物稀释1000倍，取1μl作为2st PCR 反应的模板，以AP2 Primer为 上游引物，以SP2作为下游引物。3st PCR 反应将2st PCR反应产物稀释1000倍， 取1μl作为3st PCR 反应的模板，以AP2 Primer为上游引物，以SP3作为下游引物。
三次反应的反应体系和反应条件分别参照Genome Walking Kit试剂盒。反应完成后，取3st PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，将回收产物与pEASY-T1 Cloning 载体连接构建重组质粒，转化至大肠杆菌Trans1-T1，采用蓝白斑筛选， 重组质粒经酶切验证后测序。
1.5克隆南极磷虾胰蛋白酶基因 利用已获得的南极磷虾胰蛋白酶基 因5" 端和3" 端序列设计引物，基因组DNA进行PCR扩增，反应体系及反应条件 同1.3。扩增产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，将PCR产物用QuickGel Extraction Kit回收后克隆至pEASY-Blunt Cloning Vector，经酶切鉴定重组质粒，测序。
2 结果 2.1 南极磷虾胰蛋白酶基因5" 端序列 以基因组DNA为模板，利用引 物SP1、SP2、SP3与Genome Walking Kit提供的随机引物AP1、AP2进行三轮PCR 扩增，仅用随机引物AP2得到预期的阳性结果，电泳结果见图1。将图1第二泳道 长度接近250bp的片段克隆至pEASY-T1 Cloning载体，酶切验证正确后测序得到 一段长为257bp的序列，经分析，确定这257bp含胰蛋白酶5" 端及上游28bp的序 列。
2.2南极磷虾胰蛋白酶基因序列分析 以基因组DNA为模板，利用基因 5" 和3" 端引物进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖电泳，电泳结果见图2。将图2所 得的PCR产物回收后，克隆至pEASY-Blunt Cloning载体，经酶切验证后，测序， 测得其为一961bp的序列，用"GT-AG法则"[7]分析发现该片段第267-429位置是内 含子，长度为163bp;同时具有两个完整的外显子区1-266和430-961。利用 DNATools软件进行分析后，推断胰蛋白酶含有266个氨基酸。经Clustal X软件和 NCBI Genebank软件将推测得到的氨基酸序列与已报道的胰蛋白酶氨基酸序列 进行比对，发现有较高的相似度。其与凡纳滨对虾胰蛋白酶有较高的相似度 (Identities=82%)，与日本囊对虾、中国对虾的相似度都达到了81%、81%。基因 ORF见图3。
3 讨论 胰蛋白酶的研究历经了粗酶提取、分离纯化、分子结构、蛋白亚型研 究以及基因的研究[10]，每个阶段随着实验的推进和分析数据的增加都带来新理 念的更新和研究领域的扩展，现阶段甲壳动物胰蛋白酶的研究较少。利用信号肽 预测软件SingnalP推断南极磷虾胰蛋白酶的信号肽为1-14aa，前体蛋白为1-29aa。
和其它甲壳动物的胰蛋白酶序列一样，南极磷虾胰蛋白酶的成熟肽的序列同样是 从Ile-Val-Gly-Gly开始，含有所有丝氨酸蛋白酶中都保守的活性三联体His74、 Asp125、Ser225。本实验成功克隆了南极磷虾胰蛋白酶基因，并合理推断相应的氨基酸 序列，对基因的结构研究、cDNA的获得及胰蛋白酶层面的探索具有十分积极的 意义，本实验结果为下一步基因表达低温胰蛋白酶提供了基础。
