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象耳豆根结线虫两个新基因
（MeActin和MeHsp70）的克隆与特性研究 根结线虫（Meloidogyne spp.）为植物根系内寄生物，可对农作物造成严重的危害。在国内约30多种根结线虫中，象耳豆根结线虫（M. enterolobii Yang and Eisenback, 1983）在海南岛已普遍分布，广东省也有发现。通过海南岛茄果类蔬菜根结线虫种类鉴定，发现该种群已进一步扩散，正在显示出取代南方根结线虫M. incognita，而成为我国热带亚热带地区最重要根结线虫种类的趋势。近年来对该线虫的研究备受关注，但对于其功能基因及功能基因组等分子生物学研究报道很少。本研究以该线虫为材料，采用RT-PCR、cDNA 末端快速扩增法（RACE），克隆得到M. enterolobii的Actin基因和Hsp70基因的全长cDNA序列，并对它们进行了生物信息学分析以及MeHsp70原核表达分析。主要研究结果如下：（1）MeActin基因全长cDNA序列为1298bp，包含一个全长1125bp的开放阅读框ORF，编码375个氨基酸，起始密码子在82位，终止密码子在1207位（GenBank 登录号KF534787），与已知的其它物种的Actin具有高度的保守性，与马铃薯腐烂茎线虫D. destructorto和松才线虫B. xylophilus Actin的同源性分别为99.20%和98.67%，与秀丽隐杆线虫C. elegans、人类H. sapiens相似性分别达到98.67%和97.33%。系统发育分析表明，MeActin可能是β-Actin，同时也发现了MeActin与人类的胞质Actin（β-Actin）更相似。MeActin基因的分离为M. enterolobii其它基因的表达和调控研究提供了内参基因。（2）MeHsp70基因全长cDNA序列为2203 bp，含有1959bp的开放阅读框，编码653个氨基酸，相对分子量为71.09kDa，具有3段Hsp70家族的签名序列，GenBank 登录号KF739434。同源性分析表明，氨基酸序列与其它真核生物的Hsp70序列具有很高的相似性。该Hsp70与其他物种中的Hsp70进行系统进化分析，结果显示，Hsp70的系统发育树不能体现物种间的亲缘关系，推测其反映的是不同物种间Hsp70生物学功能的相似性程度。生物信息学分析显示，MeHsp70基因所编码的蛋白质以亲水性区域为主，无信号肽，无跨膜区域，为非分泌型蛋白，该蛋白的二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主，同时MeHsp70还存在卷曲螺旋结构。构建了pEASY-E1-MeHsp70和pET30a-MeHsp70原核表达载体，当IPTG终浓度为0.4-1.0mmol/L时，能诱导表达MeHsp70。从原核生物角度分析MeHsp70的特性，发现表达MeHsp70的原核细胞明显比对照耐受高温胁迫。MeHsp70基因的克隆和表达，将为M. enterolobii的生态适应性机理研究提供依据。关键词：象耳豆根结线虫；MeActin; MeHsp70；克隆；表达1象耳豆根结线虫研究进展
M. enterolobii最早于1983年由杨宝君等在海南儋州的象耳豆树上发现并鉴定和命名［1］，后经徐建华等证明国外学者广泛报道的玛雅根结线虫M. mayaguensis为M. enterolobii 的异名［2］。M. enterolobii在全球农作物中已经成为一种经济上重要的寄生线虫[3-4]。近年来，M. enterolobii 的迅速传播也引起了学者的广泛关注。2008年，欧洲首次报道M. enterolobii，同年，欧洲植物保护组织（EPPO）报道中国出口欧洲的玫瑰花上截获到该线虫，EPPO对该线虫进行风险评估，认为对中欧地区作物存在较大威胁［5］。在国内， M. enterolobii 近年来也陆续被报道，目前在海南岛已普遍分布，广东省也有发现［6］。据调查，在海南岛主要栽培作物葫芦科蔬菜、茄果类蔬菜、南药作物和热带果树均已发现有M. enterolobii 广泛寄生[7] ，同时M. enterolobii 还可寄生携带Mi抗性基因的番茄和辣椒[8]。通过海南岛茄果类蔬菜根结线虫种类鉴定[9]，发现M. enterolobii种群已进一步扩散，正在显示出取代南方根结线虫，而成为我国热带亚热带地区最重要根结线虫种类的趋势。随着我国现代农业和设施农业的发展，温室和设施大棚不断增加而导致土壤温度的上升，使得M. enterolobii 入侵内陆地区成为可能，这将给全国的农作物生产带来威胁。近年来对M. enterolobii 的研究备受关注，但对于其功能基因及功能基因组等分子生物学研究报道很少。2 肌动蛋白简介在真核细胞中，肌动蛋白（Actin）是一种重要的收缩蛋白。Actin是引起肌肉收缩的主要成分之一，在非肌肉组织中，Actin是细胞骨架的重要组成部分，参与许多过程，如细胞运动，内吞作用，胞外分泌，吞噬作用，细胞器运动，蛋白运输和信号转导［10-13］。Actin是高度保守的蛋白质，包括哺乳动物和线虫。它被广泛用作分子标尺，预测物种之间的进化距离，评估种群变化［14-15］。在脊椎动物中，Actin蛋白有3类亚型：α、β和γ。其中α-Actin蛋白存在于肌肉组织中，β-Actin和γ-Actin蛋白是存在于胞质中。近来已经从众多的物种中克隆到Actin，例如，人类［16］、鼠［17］、果蝇 Drosophila［18］、B. xylophilus［19］。众所周知，要深入研究M. enterolobii其它功能基因，内标参照是必不可少的。采用RACE-PCR技术成功克隆了M. enterolobii肌动蛋白基因Actin的全长cDNA序列，为进一步开展研究其功能基因的表达和调控奠定基础。3 植物寄生线虫Hsp70研究进展热激蛋白（Heat shock proteins, Hsps）于1962年由遗传学家Ritossa在研究果蝇唾液腺时被发现，继而成为众多学者研究植物抗逆性机制的热点。热激蛋白家族中以Hsp70的含量最丰富、结构和功能最为保守，且充当分子伴侣，高温、干旱、低温以及重金属离子等各胁迫因子均可诱导其合成增加[20]，因而成为Hsps家族中最受关注的对象。3.1 Hsp70家族的分类Hsp70是一组在进化上高度保守的应激蛋白，包括21种蛋白质。根据人们对Hsp70的划分标准的不同，其分类也不完全相同。Hsp70可分为4种亚族成员：1）热激同源蛋白70（即Heat shock cognate 70, 或Hsc70），其在所有生物体细胞基质内均可表达，但通常情况下的表达水平低，且不易受热诱导，属于组成型Hsp70，与其它Hsp70亚族蛋白的生化特性相似，序列同源性均达95%以上[21]；2）Hsp70，又称Hsp72，一般情况下以低水平表达，但在应激条件下其表达水平极高，是诱导型的Hsp70，具有全或无的特点[22]；3）葡萄糖调节蛋白75 （Glucose regulated protein7, Grp75），主要位于线粒体内；4）葡萄糖调节蛋白78（Glucose regulated protein78, Grp78），主要位于内质网腔内。Grp75和Grp78在应激条件下的表达量很低，但是在细胞内它们均起到分子伴侣作用。Hsc70、Grp75和Grp78在无胁迫情况下均能表达，而Hsp70仅在应激条件下才诱导产生。3.2 Hsp70的结构及其生物学功能Hsp70蛋白由三部分组成，即高度保守的氨基端ATP酶区、相对保守的底物识别区和羧基端可变区。Hsp70的ATP酶活性区是位于Hsp70蛋白的氨基端约400个氨基酸残基，比羧基端部分具有更高的保守性，与不同生物Hsp70所共有的生化特性有关；Hsp70蛋白的底物识别区是羧基端约180个氨基酸残基[23]，能与主要组织相容性复合物抗原结合[24]；羧基端可变区结构尚不明确，可能与某种特定的蛋白底物相互作用有关[25]。 Hsp70在细胞内充当分子伴侣的角色，是众多学者最为关注和开展深度研究的一类热激蛋白[26]，它广泛分布于所有原核生物和真核生物的细胞内，广泛参与细胞的各种生理活动，属于非特异性的细胞保护蛋白的一种，对维持肽链正确折叠与伸展和调节蛋白内环境稳定具有非常重要的作用。 Hsp70可通过应激表达产生新的免疫物质来包裹细胞和外来抗原而保护细胞[27]，Hsp70高表达可以明显地抑制JNK的产生，从而阻断JNK介导的细胞凋亡[28]。Hsp通过C端与肽复合物结合而发挥着肿瘤免疫原性作用[29]，它不仅能够促进CTL介导的肿瘤细胞凋亡[30]，而且还能作为免疫显性抗原诱导宿主产生细胞毒T淋巴细胞[31]。Hsp70与细胞的增殖存在一定关系，当细胞从分裂期G0进入G1的同时会产生Hsp70[32]。Hsp70还具有对细胞周期长短进行控制的基本功能[33]，从而起到保护细胞的作用。在高温、低温、干旱等非生物因素胁迫下，Hsp70还能够对生物耐受性加以调节的。王枫等通过硫酸镉诱导K562细胞的Hsp70高表达，并利用RT- PCR对 Hsp70 的mRNA水平进行检测，结果是细胞作用1h 后Hsp70 的mRNA 水平显著上升，且Hsp70的mRNA水平与细胞耐热能力成正相关[34]。同时，Hsp与耐冷性的直接关系已被Collins等[35]证实。 Hsp70的N端具有ATPase功能，不仅可以调节ATP的供能系统和水解ATP，多肽或蛋白质可通过能量的释放穿透内质网或线粒体膜，还能对Hsp70与多肽复合物的结合和释放进行有效地控制[36]。正常情况下线粒体中Hsp70还可以进入线粒体腔的前导肽交联，直接参与蛋白质转运[37]。Hsp70正是通过其ATPase的作用来行使其分子伴侣的功能[38]。3.3植物寄生线虫Hsp70的研究 目前，国外已从旋尾目、杆形目和垫刃目线虫中克隆出多个Hsp70基因，并且在马来布鲁丝虫B. malayi[39]、P. trichosuri[40]和捻转血矛线虫H. contortus[41] Hsp70基因转入模式生物实验中，分析其启动子活性和应激条件下表达量的变化。进化过程中Hsp70的保守性对生物体的生命活动至关重要，如C. elegans Hsp-1基因沉默将导致其母体不育和胚胎致死等不良现象[42-43]。基于Hsp70的保守性，它可作为分析自然界的生物进化的有效依据，例如通过构建和分析植物寄生线虫Hsp70的系统发育树，就能更好地阐释植物病原线虫种类之间的进化和系统发育关系。在我国广大的热带亚热带地区，植物寄生线虫世代重叠明显，为害严重，难免存在农药滥用，这些环境因素可诱导植物寄生线虫Hsp70大量产生，所以研究Hsp70家族的结构和功能将有助于进一步揭示植物寄生线虫对环境适应性的分子机理及其抗胁迫抗逆境的机制，将为植物线虫病害的防治提供有利的证据。3.4展望 植物寄生线虫入侵寄主植物过程中导致寄主正常生长受阻而诱导寄主产生Hsp70，从而达到寄主植物的自身保护，同时线虫受到环境温度和理化因素胁迫也会产生Hsp70而使线虫最终逃避寄主抗性。这表明了Hsp70在线虫与寄主互作中均具有重要作用，也为研究它们的互作机制提供一定的理论基础。Hsp70也有望成为生物体遭受胁迫有毒物质检测的一种指示蛋白，对于环境质量的检测和评估极有可能是一个重要参数。 植物寄生线虫对高温及其它逆境因素胁迫的响应是一个多因子控制的复杂过程，对其抗逆胁迫如耐热性研究不能单纯寄希望于某种蛋白或某个基因的特性和功能分析，应结合其它相关研究综合地进行探讨，全面认识和解析植物寄生线虫的抗逆生理。况且，植物寄生线虫Hsp70基因的表达与调控机制尚未得到广泛而深入研究。 Hsp70是一类与生物抗逆性相关的热激蛋白，且与生物有机体的生长和发育高度相关。植物寄生线虫由于应激反应而产生Hsp70是其整个生活史的一部分，属于一种生理现象。鉴于Hsp70具有分子伴侣活性、细胞保护、免疫等多种重要的生物学功能，因此有不少学者已克隆并获得了不同生物体Hsp70家族成员的同源基因，从而使其成为近年来研究的一个焦点。对模式生物Drosophila和C. elegans的Hsp70生物学功能研究已极为深入。目前也已从植物寄生线虫D. destructor、H. glycines、B. xylophilus和B. mucronatus中克隆出Hsp70基因。而作为当前生产上危害严重的重要植物寄生线虫，Meloidogyne 的Hsp70研究目前却还处于空白。此外，植物寄生线虫发育与抗逆过程的Hsp70生物学功能仍未见报道。 最近研究结果显示Hsps具有“变异缓冲器”的功能，与Zhu[44]提出的“演化能力分级制约假说”整合了分子和发育遗传学成果的内涵，有利于外延现代进化理论，使Hsp70可能成为物种进化研究新工具。 基于Hsp70基因生物学功能的高度保守性，植物寄生线虫中的Hsp70可作为伴侣分子参与线虫体内蛋白质降解、蛋白质正确折叠和蛋白质间相互作用。虽然现阶段暂不能对植物寄生线虫进行基因改造，研究也仅限于蛋白质水平，但随着分子生物学与蛋白质组学技术的不断发展和成熟，尤其是通过RNAi技术对植物寄生线虫Hsp70基因进行沉默，同时分析植物寄生线虫的发育、抗逆性和寄生能力，将为开展植物寄生线虫Hsp70生物学功能及其表达调控机制研究提供有效的技术手段。随着生物体中Hsp70生物学功能和作用机理研究的不断深入，植物寄生线虫生长发育中更多的Hsp70基因将会被发现并加以调控，从而为植物线虫病害控制提供新的途径。4 研究目的与意义M. enterolobii 作为我国乃至世界热带和亚热带地区最具威胁的根结线虫种类。线虫在入侵寄主的过程中，由于逆境改变了线虫的生理和免疫因素，导致虫体处于应激状态，产生线虫的Hsp70，参与线虫分化，增强线虫毒力，逃避寄主的抗性作用。因此，Hsp70是研究线虫与逆境关系的一个很好的参数。本实验利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）结合cDNA末端快速扩增（RACE）技术，通过对M. enterolobii Hsp70基因全长克隆及其序列分析，并构建了原核表达载体，将为M. enterolobii的抗逆性及其生态适应性的研究打下基础，对于今后开展该线虫的防治工作将有重要意义。 要深入研究M. enterolobii其它功能基因，内标参照是必不可少的。采用RACE-PCR技术成功克隆了M. enterolobii肌动蛋白基因Actin的全长cDNA序列，为进一步开展研究其功能基因的表达和调控奠定基础。下篇 研究内容1材料与方法1.1供试线虫M. enterolobii原始种群来源于海南省农业科学院植保所植物线虫保存圃。1.4象耳豆根结线虫种群的纯化与培养1.4.1象耳豆根结线虫的鉴定（1）在解剖镜下，从培养M. enterolobii原始种群的番茄根结线虫上选取色泽黄、大而饱满的优质单卵块，进行孵化。提取单条根结线虫二龄幼虫DNA进行鉴定。（2）在解剖镜下，用自制的睫毛针将根结线虫二龄幼虫挑至含5μl灭菌水的载破片中，用挑针将根结线虫二龄幼虫截成2-3节，内含物溢出，用枪吸取，置于200μl的PCR管中，加灭菌水补足至8μl，再加入2μl的5×裂解Buffer（10×PCR Buffer与1000μg/ml的蛋白酶K，按1:1的体积比混合）；（3）将PCR管转移到-70℃的冰箱中，冷冻30min；（4）将冷冻后的PCR管放置到PCR仪中，65℃1h，95℃10min；（5）掌上离心机瞬时离心，上清液即可用于PCR扩增或放置-20℃冰箱中备用。（6）参考Tigano SCAR引物[45]（MK7-F：5’-GATCAGAGGCGGGCGCATTGCGA-3’,MK7-R：5’-CGAACTCGCTCGAACTCGAC-3’），采用25ul反应体系，引物各1.0ul，2×Taq MasterMix（含染料）12.5ul，模板DNA5ul，无菌水ddH2O4.5ul。PCR反应参数为94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，反应共30个循环，72℃延伸10min。（7）取5ulPCR产物于浓度为1.2%的琼脂糖凝胶上检测所扩增片段的大小，在凝胶成像系统照相和保存。1.4.2象耳豆根结线虫的培养将鉴定为M. enterolobii的二龄幼虫接种到预先培养在消毒土壤、长有4-5片真叶的番茄幼嫩根尖部，在大棚中培养约42-56d，视墒情适当浇水，注意保持土壤湿度，浇水时防止线虫被水冲淋到土壤下层，每隔20-30d施复合肥一次。