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微生物油脂工艺研究论文
微生物油脂工艺研究论文 １材料与方法 １．１材料 微生物油脂（含４３％ＡＲＡ），嘉必优生物工程（武汉）有限公司赠送；固定化酶（ＬｉｐｏｚｙｍｅＲＭＩＭ）购于北京诺维信公司；
１，３－ＡＲＡ －ＤＡＧ、１，２－ＡＲＡ－ＤＡＧ购于瑞典Ｌａｒｏｄａｎ公司；
正己烷、乙 酸乙酯、冰乙酸、甲醇均为色谱纯，购于德国ＣＮＷ公司；
氢氧化钠、尿素、无 水硫酸镁、盐酸、乙醇、石油醚、甘油、无水乙醚、４Ａ型分子筛均为分析纯， 购于国药化学试剂集团。
１．２试验仪器 分析天平（ＡＵＹ１２０，ＳＨＩＭＡＤＺＵ，Ｊａｐａｎ）；
旋转蒸发 仪（ＲＥ－５２Ａ，上海亚荣生化仪器）；
集热式恒温磁力搅拌水浴锅（ＤＦ－ １０１Ｓ，巩义市予华仪器有限责任公司）；
气相色谱仪（Ａｇｉｌｅｎｔ７８ ９０Ａ，美国Ａｇ玻椋欤澹睿艄司）；
高效液相色谱仪（Ａｇｉｌｅｎｔ１２０ ０，美国Ａｇ玻椋欤澹睿艄司）；
质谱仪（ＡＢ４０００Ｑ－Ｔｒａｐ，美国Ａ Ｂ公司）；
微型旋涡混合仪（ＷＨ－３，上海沪西分析仪器有限公司）。
１．３试验方法 １．３．１尿素包埋法纯化微生物油脂于５００ｍＬ三口瓶中加入４０ｇ 微生物油脂、２００ｍＬ无水乙醇、３０％氢氧化钠（以微生物油脂质量计）， 充氮气保护下，在恒温水浴加热搅拌器上８０℃水浴回流２ｈ，加入１００ｍＬ 的蒸馏水，搅拌均匀并冷却至室温，加盐酸酸化至ｐＨ＝１～２左右［１８］。
用无水乙醚∶石油醚＝１∶１（Ｖ／Ｖ）混合溶液萃取２～３次，将萃取液水洗 至中性，并旋转蒸发除去有机相，得到游离形态的脂肪酸混合物。将其加入到尿 素／乙醇溶液中，氮气保护下回流２ｈ后，迅速转移到２５０ｍＬ的锥形瓶中， 密封后于－２０℃冰箱中结晶过夜。所得到的尿素包合物经抽滤，旋转蒸发和萃 取后，经无水硫酸镁脱水得到纯化后的脂肪酸。称重并计算回收率。并取少量原 样品和尿素包埋后的样品进行甲酯化衍生化处理，经ＧＣ检测尿素包埋前后ＡＲ Ａ的含量变化。１．３．２酶法合成富含ＡＲＡ的１，３－ＤＡＧ按照一定的摩 尔比准确称取ＡＲＡ和甘油于２０ｍＬ两口圆底烧瓶中，氮气保护条件下，将其置于一定温度的水浴锅中，待搅拌均匀后，加入一定量的固定化酶Ｌｉ玻穑铮ｙ ｍｅＲＭＩＭ和２０％（占底物总质量）已活化的４Ａ型分子筛，在２００ｒ／ ｍｉｎ的转速下搅拌反应，按一定的时间间隔取样，采用ＨＰＬＣ－ＭＳ－ＭＲ Ｍ分析酯化后产物及各组分的相对百分含量。１．３．３脂肪酸的ＧＣ检测脂肪 酸的甲酯化衍生化处理采用本实验室建立的方法［１９］。ＧＣ检测条件为色谱 柱：ＨＰ－ＦＦＡＰ毛细管柱（Ａｇｉｌｅｎｔ，３０ｍ×０．２５ｍｍ×０． ５μｍ）；
检测器：氢离子火焰化检测器（ＦｌａｍｅＩｏｎｉｚａｔｉｏｎＤ ｅｔｅｃｔｏｒ，ＦＩＤ）；
以氮气为载气，进样口压力为２５ｐｓｉ，进样量 为１μＬ，分流比为１∶３０；
升温程序：初始温度２１０℃保持７ｍｉｎ，以 ２０℃／ｍｉｎ升温至２３０℃并保持５ｍｉｎ，总分析时间为１２ｍｉｎ；
进 样口和检测器温度分别为２６０℃和２８０℃。采用面积归一法计算脂肪酸的相 对百分含量。１．３．４产物中１，３－ＤＡＧ的ＨＰＬＣ－ＭＳ－ＭＲＭ检测 产物中１，３－ＡＲＡ－ＤＡＧ的ＨＰＬＣ检测条件为色谱柱：Ａｇｉｌｅｎｔ －ＳＩＬ（５μｍ，２．０ｍｍ×２５０ｍｍ）；
流动相：正己烷／乙酸乙酯／乙 酸＝８０∶２０∶１，（Ｖ／Ｖ／Ｖ）；
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ；
柱温：４ ０℃；
进样量：１０μＬ；
总时间：２０ｍｉｎ。检测器ＭＳ的条件为ＡＰＣＩ 模式：正离子；
ＣＵＲ：１３７．９ｋＰａ；
ＣＡＤ：ｍｅｄｉｕｍ；
ＮＣ：２ ７．３８ｋＰａ；
温度（ＴＥＭ）：４５０℃；
扫描模式：ＭＲＭ－ＥＰＩ；
扫 描速度：１０００ｕ／ｓ；
离子源气体１（ｉｏｎｓｏｕｒｃｅｇａｓ１，ＧＳ １）∶３４４．７５ｋＰａ；
辅助加热（ｉｎｔｅｒｆａｃｅｈｅａｔｅｒ，ｉ ｈｅ）：开；
ＤＰ：８０Ｖ；
ＣＥ：３５Ｖ和５５Ｖ；
碰撞电压摆幅（ｃｏｌｌ ｉｓｉｏｎｅｎｅｒｇｙｓｐｒｅａｄ，ＣＥＳ）：５Ｖ；
碰撞室输出电压（ｃ ｏｌｌｉｓｉｏｎｃｅｌｌｅｘｉｔｐｒｏｔｅｎｔｉａｌ，ＣＸＰ）１７Ｖ；
质量范围：５００～１０００ｍ／ｚ。采用面积归一法计算产物中１，３－ＤＡ Ｇ的相对百分含量。１．３．５数据分析本实验采用ＳＡＳ（ｓｔａｔｉｓｔｉ ｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍ）９．０统计软件进行数据处理，实验重 复三次，取其平均值。用Ｏｒｉｇｉｎ作图工具，对结果进行分析。
２结果与分析 ２．１尿素包埋法纯化微生物油脂中的ＡＲＡ 尿素包埋法作为一种普遍的富集ＬＣ－ＰＵＦＡｓ的方法，一直受到人们 的青睐［２１］。本实验中，当尿素∶混合脂肪酸∶甲醇比为２ｇ∶１ｇ∶２０ ｍＬ，结晶温度为－２０℃时，经ＧＣ检测分析后，ＡＲＡ的相对百分含量由原来的４３％（如图１中Ａ）提高到８３％，且回收率为５４．３５％。力为２５ ｐｓｉ，进样量为１μＬ，分流比为１∶３０；
升温程序：初始温度２１０℃保 持７ｍｉｎ，以２０℃／ｍｉｎ升温至２３０℃并保持５ｍｉｎ，总分析时间为 １２ｍｉｎ；
进样口和检测器温度分别为２６０℃和２８０℃。采用面积归一法 计算脂肪酸的相对百分含量。１．３．４产物中１，３－ＤＡＧ的ＨＰＬＣ－Ｍ Ｓ－ＭＲＭ检测产物中１，３－ＡＲＡ－ＤＡＧ的ＨＰＬＣ检测条件为色谱柱：
Ａｇｉｌｅｎｔ－ＳＩＬ（５μｍ，２．０ｍｍ×２５０ｍｍ）；
流动相：正己烷 ／乙酸乙酯／乙酸＝８０∶２０∶１，（Ｖ／Ｖ／Ｖ）；
流速：０．５ｍＬ／ｍ ｉｎ；
柱温：４０℃；
进样量：１０μＬ；
总时间：２０ｍｉｎ。检测器ＭＳ的 条件为ＡＰＣＩ模式：正离子；
ＣＵＲ：１３７．９ｋＰａ；
ＣＡＤ：ｍｅｄｉ ｕｍ；
ＮＣ：２７．３８ｋＰａ；
温度（ＴＥＭ）：４５０℃；
扫描模式：ＭＲ Ｍ－ＥＰＩ；
扫描速度：１０００ｕ／ｓ；
离子源气体１（ｉｏｎｓｏｕｒｃｅ ｇａｓ１，ＧＳ１）∶３４４．７５ｋＰａ；
辅助加热（ｉｎｔｅｒｆａｃｅｈ ｅａｔｅｒ，ｉｈｅ）：开；
ＤＰ：８０Ｖ；
ＣＥ：３５Ｖ和５５Ｖ；
碰撞电压 摆幅（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｅｎｅｒｇｙｓｐｒｅａｄ，ＣＥＳ）：５Ｖ；
碰撞 室输出电压（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎｃｅｌｌｅｘｉｔｐｒｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｃ ＸＰ）１７Ｖ；
质量范围：５００～１０００ｍ／ｚ。
２．２产物中１，３－ＤＡＧ的ＨＰＬＣ－ＭＳ－ＭＲＭ检测 脂肪酸与甘油酯化反应的产物中有ＴＡＧ、１，２－ＤＡＧ、１，３－Ｄ ＡＧ、１（２）－ＭＡＧ和未反应的脂肪酸及甘油。本实验就产物中主要的产物 ＴＡＧ、１，２－ＤＡＧ、１，３－ＤＡＧ进行定量检测，通过优化色谱条件， 最终确定流动相：正己烷／乙酸乙酯／乙酸＝８０∶２０∶１，（Ｖ／Ｖ／Ｖ）；
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ；
进样量：１０μＬ；
总时间：２０ｍｉｎ时，分离 效果较好。
２．３脂肪酶催化合成 １，３－ＤＡＧ的单因素实验２．３．１反应时间对酶促酯化合成１，３ －ＤＡＧ的影响本实验在甘油与ＡＲＡ摩尔比为１∶２，脂肪酶添加量为５％ （以底物总质量计），反应温度为５０℃的条件下，定期取样分析产物中１，３ －ＤＡＧ含量的变化。结果如图３所示，随着反应时间的延长，底物中１，３－ ＤＡＧ的相对百分含量呈现先增加后减小的趋势，并在２ｈ时，达到最大值６８． ９％；
２ｈ后，１，３－ＤＡＧ的相对百分含量明显下降，到１０ｈ时降为１６． １％并趋于稳定。这可能是因为随着反应时间的延长，１，３－ＤＡＧ发生了酰基转移，进而转化为１，２－ＤＡＧ或者ＴＡＧ，从而使反应产物中１，３－Ｄ ＡＧ的含量降低。因此，２ｈ为最佳的反应时间。２．３．２反应温度对酶促酯 化合成１，３－ＤＡＧ的影响本实验在反应时间（２ｈ）、脂肪酶添加量（５％） 和底物摩尔比（甘油／ＡＲＡ＝１∶２）一定的条件下来优化温度对酯化合成１， ３－ＤＡＧ的影响。由图４可知，随着反应温度的升高，１，３－ＤＡＧ的相对 百分含量呈现先增加后减小的趋势，并在５０℃时达到最大，为６８．３％。随 着温度的继续升高，其含量呈现递减的趋势。这可能是由于温度的升高促使脂肪 酶的活力逐渐提高，而且温度升高有利于底物混合均匀，降低反应体系的黏度， 从而更有利于酯化反应的进行。然而，随着温度进一步升高，酰基转移率也相应 的增加，从而使１，３－ＤＡＧ的相对百分含量降低；
此外，长时间的高温反应 环境条件会造成部分酶活力丧失，甚至会造成ＡＲＡ发生氧化，均可能导致１， ３－ＤＡＧ相对百分含量的降低。因此，综合考虑以上因素，５０℃作为反应温 度较佳。２．３．３不同底物摩尔比对酶促酯化合成１，３－ＤＡＧ的影响在反 应温度５０℃、反应时间２ｈ及脂肪酶添加量为５％的条件下，考察不同底物摩 尔比对反应结果的影响。由图５可知，在一定范围内，随着体系中ＡＲＡ含量的 增加，产物中１，３－ＤＡＧ的相对百分含量逐渐增加，并在甘油／ＡＲＡ为１ ∶２时，１，３－ＤＡＧ的相对百分含量最高达７２．１％。然而随着ＡＲＡ的 继续增加，产物中１，３－ＤＡＧ的量开始降低，这可能是过量的ＡＲＡ与产物 中的１，３－ＤＡＧ进一步发生反应生成了ＴＡＧ。因此综合考虑，反应体系中 底物摩尔比甘油／ＡＲＡ采用１∶２为宜。２．３．４脂肪酶添加量对酶促酯化 合成１，３－ＤＡＧ的影响在反应时间２ｈ、反应温度５０℃和底物摩尔比（甘 油／ＡＲＡ）为１∶２的条件下，设计实验考察脂肪酶添加量对产物中１，３－ ＤＡＧ的影响。如图６所示，脂肪酶的添加量对反应有显著影响。脂肪酶添加量 在１％～５％的范围内，１，３－ＤＡＧ的相对百分含量随着脂肪酶添加量的增 加而增加，并在酶添加量为５％时，１，３－ＤＡＧ相对百分含量达到最大值８ ２．８％；
当继续增加酶量到１０％时，１，３－ＤＡＧ的含量有所降低，这可 能是因为底物已经被脂肪酶分子所饱和，且随着脂肪酶添加量的增加，一定程度 上也增加了发生酰基转移的几率，将１，３－ＤＡＧ转化为１，２－ＤＡＧ或者 ＴＡＧ。综合考虑以上因素，最佳的脂肪酶添加量为５％。
２．４响应面试验结果与分析 ２．４．１回归方程的建立与分析基于单因素试验结果，选取温度（Ｘ１）、 时间（Ｘ２）、酶加量（Ｘ３）及底物摩尔比（Ｘ４）为自变量，以产物中１， ３－ＤＡＧ相对百分含量（以峰面积表示）Ｙ为响应值，采用中心组合设计实验，对所获得的单因素条件进行响应面优化。以Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｅｋｅｎ实验设计 获得数据为基础，在此基础上利用ＳＡＳ９．０软件对获得的数据进行拟合分析， 得到１，３－ＤＡＧ含量的动态参数方程如下：Ｙ＝１５２３００＋２０５６２． ５８Ｘ１＋３６３３７．５Ｘ２＋４７１２５Ｘ３＋１７８０．２５Ｘ４－２０ ２１３．３７Ｘ１Ｘ１＋１５０２．２５Ｘ１Ｘ２＋１２５４５Ｘ１Ｘ３－１２ ９８５Ｘ１Ｘ４－３８７５８．７５Ｘ２Ｘ２＋１０３０２．５Ｘ２Ｘ３＋１２ ９４６．７５Ｘ２Ｘ４－３０５７２．５Ｘ３Ｘ３＋１５１０７．５Ｘ３Ｘ４－ ２０１８０．３７Ｘ４Ｘ４。从回归方程模型系数的方差分析结果（表３）可以 看出，模型Ｐ＝０．００６３＜０．０１，说明回归模型方程极显著。模型的Ｒ ２值为０．８４０７，表明优化好的参数值有大约８４．０７％来源于回归方程 模型，同时模型的失拟项Ｐ＝０．５４４８６９＞０．０５，符合失拟项不显著 的要求。这表明此模型可以很好的用来预测最优化条件。且根据方差分析可知， 各因子对１，３－ＤＡＧ的影响主次关系为Ｘ３＞Ｘ２＞Ｘ１＞Ｘ４，即酶添加 量最大，其次为时间、温度，底物摩尔比最小。２．４．２响应面优化及模型验 证为了更直观地显示各因素之间的关系，对经响应面法优化后的结果进行规范分 析，考察ＳＡＳ９．０所拟合的响应曲面形状，获得响应面立体图及对应的等高 线图，如图７所示，模型具有稳定点，各因素间的交互作用较明显。经拟合分析 后，得出酶促酯化合成１，３－ＤＡＧ的稳定值及最优条件，最佳工艺参数为：
Ｘ１（温度）５７℃，Ｘ２（时间）２．７ｈ，Ｘ３（酶量）７．９％，Ｘ４（摩 尔比）２．５∶１。在此最优条件下，进行三次重复验证实验，１，３－ＤＡＧ 的实际平均峰面积为９．８×１０４，与理论值（１．０×１０５）非常接近， 说明该预测模型是可靠的；
并且，此时１，３－ＤＡＧ在整个ＤＡＧ和ＴＡＧ混 合物中的相对百分含量为７３．５％，且１，３－ＡＲＡ－ＤＡＧ含量为３８． １％。
３结论 本文系统地研究了无溶剂体系中，以富含ＡＲＡ的微生物油脂为原料，通 过酶促酯化反应合成富含ＡＲＡ的１，３－ＤＡＧ的工艺。得出合成富含ＡＲＡ 的１，３－ＤＡＧ的最佳工艺条件为：反应温度５７℃，反应时间２．７ｈ，酶 添加量７．９％，ＡＲＡ与甘油的底物摩尔比为２．５∶１，在此最优条件下， １，３－ＤＡＧ在反应产物中ＤＡＧ和ＴＡＧ混合物中的相对百分含量为７３． ５％，且１，３－ＡＲＡ－ＤＡＧ含量为３８．１％，结果较为理想。本研究所 建立的酶法合成富含ＡＲＡ的１，３－ＤＡＧ的工艺研究，对进一步开发利用微 生物油脂资源，提高微生物油脂的附加值有着非常重要的实际意义。这方面研究将在今后生产有利于人体健康和食品加工的专用油脂、富含ＬＣ－ＰＵＦＡ的功 能性油脂和结构脂质产品的研发等领域有着广阔的应用前景。
作者：刘四磊 刘伟 董绪燕 魏芳 王湘 吕昕 钟娟 吴琳 陈洪 单位：中 国农业科学院油料作物研究所 湖北省脂质化学与营养重点开放实验室 华中科 技大学生命科学学院
