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解析异位种植结肠癌肝转移
解析异位种植结肠癌肝转移 结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年超过１００万人诊断为结 直肠癌［１］，近年来其发病率在欧洲跃居第１～２位［２］，我国居第４位［３］。影响患者预后的主要问题是肿瘤复发或转移，其中肝脏是结直肠癌血行转移最主 要的靶器官［４］。大约２５％的患者在诊断结直肠癌时就已出现肝转移［５、 ６］。手术切除结直肠肿瘤后仍有大约２０％～５０％的患者出现肝转移，其５ 年存活率约１０％～５８％［７］。研究和建立结直肠癌肝转移的动物模型，特 别是具有高转移率的肝转移动物模型，对研究结直肠癌肝转移的治疗以及抗肿瘤 药物的筛选等具有重要意义。结肠癌肝转移种植性动物模型主要有肿瘤细胞原位 种植和异位种植，后者主要包括肿瘤细胞肝门静脉注射（Ｉｎｔｒａｐｏｒｔａ ｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ），脾脏种植（Ｉｎｔｒａｓ－ｐｌｅｎｉｃｉｎｊｅｃ ｔｉｏｎ）两种方式。虽然这两种异位种植的动物模型应用广泛，关于它们形成 结肠癌肝转移效率及效果的认识还不统一［８］。早在２０世纪８０年代初就有 学者进行研究，迄今为止已有多种结肠癌肝转移异位种植动物模型报道，各具优 缺点［９］。本研究对结肠癌异位种植动物模型肝门静脉注射法和脾脏种植法的 肝转移率及其效果进行分析比较，为结肠癌肝转移的预防和治疗提供动物模型。
１材料与方法 １．１实验材料 １．１．１实验动物ＢＡＬＢ／ｃ小鼠共６０只，由广西医科大学实验动 物中心提供，雌雄各半。体重２０～２５ｇ，周龄６～８周。合格证号：ＳＣＸ Ｋ桂２００３－０００３。在ＩＩ级动物实验室饲养。
１．１．２实验瘤株ＢＡＬＢ／ｃ小鼠结肠腺癌细胞株（ＣＴ２６）由美 国引进，第二军医大学曹雪涛教授惠赠。常规培养ＣＴ２６细胞于含１０％胎牛 血清的ＲＰ－ＭＩ－１６４０营养液。取指数生长期的细胞（图１），消化吹打 成单细胞悬液，９５２ｇ（１０００ｒｐｍ）离心５ｍｉｎ，弃上清液，加适量 不含血清的ＲＰＭＩ－１６４０营养液调整细胞浓度至１×１０６个／ｍＬ。图 １对数生长期ＣＴ２６细胞（１０×１０） １．２实验方法 １．２．１脾脏种植不保留脾脏法造模３０只ＢＡＬＢ／ｃ小鼠称重后采用腹腔内注射法麻醉，选用０．２％的戊巴比妥钠，剂量控制在４０～５０ｍｇ ／ｋｇ，小鼠麻醉成功后固定于手术台上。常规皮肤消毒，取左侧腋中线纵行切 口进腹腔，长约１ｃｍ，显露柳叶状脾脏，牵出腹腔外，用０．２ｍＬ注射器（３ １Ｇ针头）从脾下极进针，注入瘤细胞液０．２ｍＬ。拔针后酒精棉球按压针眼 约３ｍｉｎ，促进瘤细胞经脾静脉进入肝脏，查无出血，结扎脾血管及胃短动静 脉，切除脾脏，再次查无出血，依次间断缝合肌肉、皮肤，关腹。术后继续在Ⅱ 级动物实验室饲养。
１．２．２肝门静脉注射法造模３０只ＢＡＬＢ／ｃ小鼠称重后采用腹腔 内注射麻醉，选用０．２％的戊巴比妥钠，剂量控制在４０～５０ｍｇ／ｋｇ， 小鼠麻醉成功后固定于手术台上。常规皮肤消毒，取腹正中切口进腹腔，长约１ ｃｍ，显露肝门静脉，用０．２ｍＬ注射器（３１Ｇ针头）从肝门静脉与水平成 ３０度进针，注入瘤细胞液０．２ｍＬ。拔针后酒精棉球按压针眼约１５ｍｉｎ， 查无出血，依次间断缝合肌肉、皮肤，关腹。术后继续在Ⅱ级动物实验室饲养。
１．３观察指标 小鼠苏醒后常规饲养，每日观察其饮及活动情况，所有小鼠待其自然死亡， 观察生存期。小鼠死亡后均剖腹观察腹腔内肿瘤生长情况，肝转移率及肝脏成瘤 情况，肺转移率，切取肝脏转移瘤置于１０％中性福尔马林液中固定，石蜡包埋， ＨＥ染色，进行常规病理组织学观察。１．４统计学方法采用ＳＰＳＳ１３．０ 软件进行数据分析，卡方检验比较计量资料的组间统计差别，ｔ检验比较计数资 料的组间统计差异，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
２结果 ２．１大体观察 两组小鼠接种后大体观察相似。术后１０ｄ内ＢＡＬＢ／ｃ小鼠活动如常， 体形无明显变化。１０ｄ后个别小鼠开始出现摄食量下降，行动渐迟缓，消瘦， 腹部渐膨隆，但尚无小鼠死亡。２０ｄ后小鼠进一步消瘦，腹部膨隆明显，严重 者出现死亡，第一只小鼠自然死亡时间出现在肝门静脉注射组术后第２２ｄ。术 后第３０～５５ｄ，大部分小鼠死亡，最后一只死亡时间出现在脾脏注射组术后 ５８ｄ。
２．２肝转移率两组分别成功接种３０只小鼠，肝门静脉组２９只有肝转移灶形成，１只 未发现肝脏表面及切面转移灶，肝脏转移率为９６．７％。脾脏注射组２４只小 鼠发现肝转移灶，肝脏转移率为８０％。两组间差异具有统计学意义（Ｐ＝０． ０４４，表１）。
２．３肝转移灶成瘤情况 肝转移灶成瘤情况描述为：成瘤级别（高）－转移灶布满全肝；
成瘤级别 （中）－转移灶占全肝１／２及以上；
成瘤级别（低）－转移灶占全肝低于１／ ２。肝门静脉组成瘤级别高、中、低的小鼠数量分别为：１４只、８只、６只；
脾脏种植切脾组成瘤级别高、中、低的小鼠数量分别为：９只、６只、１５只。
两组相比，肝门静脉组肝脏转移灶高转移和中转移例数均比脾脏种植组多（图２）。
２．４生存时间 肝门静脉组３０只小鼠术后自然生存时间为２２～５５ｄ，平均（３４． ６±８．７）ｄ。脾脏种植切脾组３０只小鼠术后自然生存时间为３０～５８ｄ， 平均（４９．３±７．８）ｄ。两组间差异具有统计学意义（Ｐ＝０．０００）。
２．５肺转移率 两组分别成功接种３０只小鼠，肝门静脉组１８只有肺转移灶形成，肺转 移率为６０％。脾脏种植切脾组１２只发现肺转移灶，肺转移率为４０％。两组 间差异无统计学意义（Ｐ＝０．１２１）。２．６病理观察镜下见肝转移灶癌细 胞聚集成团，伴有癌结节形成，癌细胞形状不规则，分化差，异形性明显，胞质 少，核大，深染不规则，核分裂像易见，符合低分化腺癌的结构特征（图３）。
３讨论 研究和建立具有高转移率的结肠癌肝转移动物模型一直是结直肠癌研究 的重点和难点之一。目前，结直肠癌肝转移动物模型大体包括三种类型，基因工 程模型，自发或诱发模型和种植性模型，而种植性模型目前应用较为广泛，根据 种植的部位又可分为肿瘤细胞株原位和异位种植模型。原位移植模型是将肿瘤组 织通过手术种植在体内的相应部位，从而进行相应部位肿瘤研究的方法。原位移 植模型目前应用较为广泛，但对于研究结肠癌肝转移的治疗特别是药物筛选而言， 原位移植模型所达到肝转移率还是不能令人满意。结直肠癌异位种植模型肿瘤接 种部位包括皮下、脾脏、肝脏、门静脉和肠系膜静脉等。皮下种植模型因皮下生长的肿瘤通常易被纤维膜所包裹，难以发生肿瘤浸润和转移，表现出极低的肿瘤 转移率［１０］。肝脏种植模型是将结直肠癌细胞或组织块直接种植于肝脏而形 成转移瘤。据国外研究报道，此法小鼠肝脏成瘤率也仅为８０％［１１］。脾脏 和门静脉接种均表现出极高的肝转移率，国外研究报道均为１００％［１２、１ ３］，然而他们所用的是裸小鼠。本研究采用具有免疫能力的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠 对比脾脏和肝门静脉种植法的肝转移率及肝脏成瘤效果。本研究中，肝门静脉法 具有更高的肝转移率及肝脏成瘤效果，而脾脏种植切除脾脏法在生存时间和操作 难易程度上表现出优势，两者的肺转移率差异无统计学意义。肝门静脉法模型肝 转移率为９６．７％，与国外报道结果相似［１４］，比脾脏种植法高；
同时在 肝脏成瘤效果方面，肝门静脉法有更多的例数出现全肝或肝脏一半以上的转移， 能更好地满足各种检测方法取材的需要；
缺点为生存时间相对较短，并且实验时 应注意不能选择过粗的针头，否则容易引起拔针后门静脉不容易止血而导致小鼠 死亡，不能注射过多的肿瘤细胞，否则易出现肝血管栓塞造成小鼠死亡［１５］。
而脾脏种植切除脾脏法虽然肝转移率稍低，但具有更长的生存时间及更易操作， 较适合验证周期较长的药物实验，同时，它很好地模拟了结直肠癌根治术后因血 行转移而发生肝转移的过程。本研究中的两种异位种植模型均能达到很高的肝转 移，重复性好，但属于实验性方法产生的肝转移的最后阶段，并非研究结肠癌肝 转移的全过程。在选择动物模型中注意实验方案选择适合的模型。本研究建立并 对比了两种具有高转移率的结肠癌肝转移小鼠模型，肝门静脉法在肝转移率成肝 脏成瘤效果方面更具优势，适合对肝转移率成取材要求较高的实验研究；
而脾脏 种植切除脾脏法则更适合验证周期较长的药物实验。
