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五味子为木兰科植物五味子的成熟果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效。北五味子主产于吉林、辽宁、黑龙江，具有很高的药用价值[1]。建立一种高效、快速、准确测定五味子中有效成分的方法，对五味子的质量进行检测跟踪[2，3]，意义将非常重大，同时也为北五味子规范化种植基地的药材品质评价提供依据。现在国内外对于木脂素的测定方法研究的比较多[4~7]，但各种方法都有不同程度的缺陷。本研究采用高效液相色谱法对五味子中4种木脂素类化合物的同时测定进行了系统的研究，实现了4种化合物的同时测定。经实际样品检测和分析性能研究表明，方法简单、快速、准确、可靠。
1器材
1.1仪器与试剂Agilent HP1100高效液相色谱仪(配有四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器);色谱柱：迪马公司 Diamonsil(钻石)C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm); 超纯水发生系统(MILLIPORE公司);LG10-2.4A型高速离心机(北京医用离心机厂);C18固相萃取小柱(3 ml，100 mg，waters公司);TurboVap LV氮气吹干仪(Zymark公司);Ф13 mm 0.22 μm一次性微孔样品过滤膜(希波氏);SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)。
1.2试剂与标准品甲醇，色谱纯(Fisher Chemicals公司);标准品，五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素，均为化学对照品(中国药品生物制品检定所);乙腈，色谱纯(Fisher Chemicals公司);丙酮，分析纯(国药集团化学试剂有限公司);苯，分析纯(沈阳市新西试剂厂);正己烷，分析纯(国药集团化学试剂有限公司);环己烷，分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。标准储备液的配制：分别准确称取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素标准品0.010 0 g于小烧杯中，加入乙腈溶解，转移于10 ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，制得各储备液的浓度均为1 000 μg/ml。北五味子1号和北五味子2号药材，均由辽宁金世中药材科技开发有限公司提供。
1.3色谱条件色谱柱为迪马公司 Diamonsil(钻石)C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为A乙腈，B水; 梯度洗脱程序：0～25 min流动相配比为乙腈∶水=50∶50 (V/V);25～35 min流动相比例线性变化到70∶30(V/V);35～40 min保持乙腈∶水=70∶30(V/V);40～44 min再线性变化到80∶20(V/V)。
2方法
2.1样品预处理C18固相萃取柱活化：分别用10 ml甲醇和10 ml水活化，保持水的液面为2 mm左右时上样。
准确称取0.100 0 g样品于比色管中，加入10 ml乙腈超声40 min左右，将所得液体和固体混合物过滤，得到澄清溶液和固体残渣，用乙腈将固体残渣洗涤数次，合并乙腈液和原澄清溶液，将合并液旋转蒸发至干，加入10%甲醇水溶液10.00 ml溶解，取出1.00 ml慢慢加入到已活化的C18固相萃取柱中，全程的层析过程中不应使柱干涸，用5 ml水做淋洗液洗柱，弃去全部淋洗液，用5 ml甲醇做洗脱液洗柱，收集洗脱液，用氮气吹干仪吹干洗脱液，然后加入1.00 ml乙腈溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤后待测。
2.2仪器操作按分析方法中设定的流动相配比、流速、柱温、检测器温度平衡整个液相色谱系统。待基线完全稳定后进样分析，同时在Offline下进行数据处理与报告编辑。每次做完实验后应先用20倍柱体积的溶液(二次蒸馏水∶乙腈=95∶5)冲洗色谱柱(注意此时应关闭检测器)，最后用纯乙腈冲洗约20 min，封柱，待用。
3结果与讨论
3.1色谱柱的选择由于本实验欲分离的对象均为亲脂性的物质，又因为反相化学键合色谱柱具有柱效高、重现性好、选择性高、色谱柱寿命长、可进行梯度洗脱等优点，可选用反相化学键合色谱法进行分析，而且反相色谱使用水作为流动相的主体能大大降低实验成本[8,9]。为此本实验选择反相化学键合色谱柱，即C18柱为色谱分离柱。
3.2流动相体系的选择本实验分别考察了甲醇-水流动相体系和乙腈-水流动相两种体系下，4种标准物质及其样品的色谱分离情况，实验得出，4种被测物质在相同配比的两种体系下均能得到洗脱和分离，而应用甲醇-水体系分析时间长，后出峰物质的峰形变宽，而采用相同配比的乙腈-水体系可以大大缩短组分的保留时间，而且各物质的峰形尖锐，对称度好。实验结果表明样品中的干扰物质很多，欲满足分析要求，必须使各种物质有良好的分离度和洗脱效果，并且减少拖尾和包峰情况，应用乙腈-水体系能明显抑制峰形变宽，而且乙腈-水体系溶剂强度大、黏度小，会使各物质的洗脱和分离效果更好。为此本实验选择乙腈-水为流动相体系。
3.3流动相配比及洗脱方式和洗脱程序的确定本实验考察了样品的色谱分离情况，样品中的干扰物质很多，单纯考虑标准物质的分离来确定流动相的配比已经不能满足分离分析的要求，乙腈和水的配比调整为65∶35，此时标准物质已能达到很好的分离，但样品中五味子醇甲和五味子酯甲与周围的干扰物质仍然无法分开，而五味子甲素和五味子乙素的分配比较大，虽然已经彼此分离开且周围干扰较少，但色谱峰变宽。由此可见欲使被测物质与其他的干扰物质达到良好的分离，就需降低流动相的洗脱强度，即减少流动相中乙腈的含量，这样会导致五味子甲素和五味子乙素的洗脱时间延长，为此可采用梯度洗脱方式进行分离，先以低强度流动相洗脱[10]，即开始时乙腈含量较少，待五味子醇甲和五味子酯甲以理想的分离度彼此分开后，逐渐增加乙腈的含量，即增加流动相的洗脱强度，使强保留组分五味子甲素和五味子乙素能在合适的保留时间内以满意的分离度从色谱柱中流出，从而提高分离效果，改变峰形，缩短分析时间[11]。为获得最佳洗脱效果，实验设计了4套梯度洗脱程序，考察了不同的梯度洗脱条件对各组分分离的影响。通过实验得到，4号梯度洗脱程序的色谱图中4种待测物质的分离效果最好，在分离效果良好的基础上尽量缩短分析时间。因此，选择4号梯度洗脱程序为最佳的梯度洗脱程序。如表1所示。表1最佳的梯度洗脱程序
3.4检测波长的选择进行高效液相色谱分析时经常采用的检测器是紫外-可见检测器，其优点是灵敏度高，波长范围宽，但只能在同一波长下检测，对分析多种物质不能同时选择每种物质的最大吸收波长[12]，这样会使某些物质的检测灵敏度降低。而本实验采用DAD检测器，该检测器可以动态地快速扫描被测组分的紫外-可见吸收光谱图，可直接得到每个物质的最大吸收波长，而且可在每个色谱峰出峰之前，动态调整检测器波长，完全可以以每个组分的最大吸收波长作为检测波长以此来提高检测灵敏度，并能有效地减小基线漂移。实验分别取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素标准溶液进样分析，采用DAD检测器于190～900 nm范围内进行紫外光谱扫描。结果如图1所示。图14种组分的紫外-可见吸收光谱图由4种组分的紫外-可见吸收光谱可以看出，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素均在216 nm处有最大吸收峰，五味子酯甲在222 nm处有最大吸收峰。所以本实验选择五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的检测波长为216 nm，五味子酯甲的检测波长为222 nm。
3.5柱温的选择本实验在上述确定的实验条件下以流速0.8 ml/min，进样量10 μl，分别在20，25，30，35，40 ℃进行柱温选择实验，考察了柱温对样品中各物质分离度及理论塔板数的影响。实验结果表明各种物质的分离度随着柱温的升高呈不同的变化趋势，只有在20℃和25℃时各物质的分离度才大于1.0，可以满足分析要求。实验得出，在20℃和25℃时，五味子醇甲和五味子甲素的柱效变化不大，但五味子酯甲和五味子乙素柱效在25℃时最高，为此，本实验选择柱温为25℃。
3.6流速的选择由实验中可以看出，流动相流速对4种组分的保留时间有一定的影响，随着流速的增大，各组分的保留时间提前，分析效率提高。但当流动相流速过大时，系统的压力太高，容易冲塌柱。当流速为0.8 ml/min时，五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的柱效达到最高，为此，本实验采用0.8 ml/min为最佳流速。
3.7样品前处理方法的确定
3.7.1提取方法、提取试剂和提取条件的确定本实验考察了3种提取方法，即超声提取法、冷浸提取法和回流提取法。通过实验发现回流提取法对各种物质的提取结果较低，而且费时费力，所以实验主要对超声提取法和冷浸提取法进行了比较，提取中又选用不同的提取溶剂和提取时间来比较各组分的提取结果，在超声提取法中主要选择正己烷、醋酸乙酯、乙腈和环己烷进行比较，在冷浸提取法中主要选择正己烷、苯、醋酸乙酯、乙腈和甲醇进行比较。实验表明，应用超声提取法可选择乙腈超声，4种物质的提取量最多，而且超声时间长提取量多，但时间太长，分析周期延长，为此实验选择超声40 min。实验还得出，用正己烷冷浸12～16 h 4种物质均获得比较好的提取量，同超声提取法相比较，提取量相当，但由于冷浸需要的时间比较长，为此本实验选择乙腈超声40 min进行提取。
3.7.2固相萃取柱的选择本实验分别考察了氧化铝和C18两种固相萃取柱对被测物质的纯化和富集情况，结果表明，用氧化铝萃取，被测组分难以被洗脱，在吸附剂中的保留强，为此实验也考察了应用不同的淋洗液和洗脱液，以及增加洗脱液的用量来洗脱被测物质，但被测物质仍然无法被很好的洗脱，回收率较低。而应用C18萃取的结果与氧化铝不同，洗脱的效果比较好，实验同样也考察了不同淋洗液和洗脱液对样品纯化和被测物质洗脱效率的影响。实验表明采用C18进行固相萃取，分别用10 ml甲醇和10 ml水活化后上样，然后用5 ml水做淋洗液，5 ml甲醇作为洗脱液进行净化，可以达到良好的效果。
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来源：中国论文下载中心 [ 11-04-24 16:22:00 ] 编辑：studa20
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3.8干扰实验实验中用到甲醇作洗脱溶剂，在检测范围内很可能出现甲醇溶剂峰的干扰[13]，为此取少量甲醇用氮气吹干仪吹干后，用流动相定容，在上述确定的色谱条件下进样测定，结果表明甲醇在3 min时出峰，而样品中待测物质第一峰的出峰时间为13 min，说明甲醇溶剂峰对4种组分的分析不产生干扰。
3.9标准曲线分别移取浓度为1 000 μg/ml的4种木脂素标准储备液0.02，0.08，0.20，0.40，1.00，2.00 ml于10 ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，配制成浓度为2.00，8.00，20.00，40.00，100.00，200.00 μg/ml 的标准系列溶液，按最佳色谱条件进样分析，以峰面积为纵坐标，以对应的浓度为横坐标做各种组分的标准曲线，如图2所示。经线性回归计算，得到4种化合物的线性方程及相关系数。见表2。由表2可以看出，该4种化合物的线性关系良好，相关系数在0.9994～0.9998之间，可以满足日常分析的要求。
3.10检出限和线性范围检出限又称敏感度，是指产生一个能够确证在试样中存在的分析信号所需要的该组分的最小含量。亦即待测组分所产生的信号强度等于其噪声强度标准偏差三倍时所对应的质量浓度或质量，用最小检测浓度μg/ml(μg/g)或最小检测质量μg/ng来表示。检出限是衡量一个分析方法的重要指标，它能更全面地反映检测器质量，检测方法的灵敏度[14]。为此在最佳色谱条件下测定了4种化合物的检出限及线性范围。结果见表3。由表3可以看出，本实验建立的HPLC分析北五味子中4种木脂素成分的方法灵敏度高、检出限低、线性范围宽。图23种组分的标准曲线经线性回归计算，得到4种化合物的线性方程及相关系数见表2。表2标准曲线的回归方程及相关系数表3各组分的检出限及线性范围 3.11仪器精密度实验实验在最佳色谱条件下，以1.00 μg/ml的标准溶液平行测定18次，由测定结果可以看出，4种物质的相对标准偏差均小于3.0%，测定结果的可靠性可以满足分析的要求。
3.12样品测定在最佳实验条件下，测定北五味子样品中4种组分的分析结果见表4。表4北五味子的分析结果
3.13回收率实验本实验采用标准加入法进行回收率实验。取北五味子2号样品0.100 0 g，加入2 ml 200 μg/ml的标准溶液，即提取液中各组分的浓度为40 μg/ml，按前述提取方法平行实验7次，由实验得出，五味子中4种组分的平均回收率为90.23%～95.24%，相对标准偏差为3.2%～4.9%。说明该方法的准确度和精密度较高，可以满足日常分析检测的要求。
3.14标准溶液的稳定性为考察溶液的稳定性[15]，配制浓度为40.00 μg/ml使用液，密封避光保存。在不同的时间进样测定，实验结果表明，浓度为40.00 μg/ml标准溶液在第20天时五味子醇甲、五味子酯甲和五味子乙素的变化率都超过了10%，在第10天时4种物质的变化率均小于10%，说明标准溶液在10 d内是基本稳定的。峰面积的升高，说明溶液浓度在增大，溶剂挥发，因此，标准溶液应放置于温度低的地方，使用时注意防止挥发。
4结论
采用高效液相色谱法测定北五味子中木脂素类化合物的含量，通过实验得到以下结论。①通过条件实验，确定了最佳实验条件：Diamonsil(钻石)C18柱;DAD检测器检测，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的检测波长均为216 nm，五味子酯甲的检测波长为222 nm;流动相乙腈-水，采用梯度洗脱，洗脱程序为0～25 min乙腈:水=50∶50(V/V)，25～35 min流动相比例线性变化到70∶30(VV)，35～40 min保持乙腈:水=70∶30(V/V)，40～44 min再线性变化到80∶20(V/V);柱温25℃;流速0.8 ml/min;进样量10.0 μl。②在最佳实验条件下4种木脂素类化合物能与样品中其他杂质达到良好的分离，通过定性分析4种物质的出峰顺序为五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素。③在最佳色谱条件下绘制标准曲线，在0.15～200 μg/ml的范围内线性良好，相关系数为0.999 4～0.999 8。经计算各组分的最小检测浓度为0.04～0.05 μg/ml。④本实验对样品进行了测定，并考察了方法的精密度和准确度。对样品进行了加标回收实验，平均回收率为90.23%～95.24%，相对标准偏差为3.2%～4.9%。说明该方法的准确度和精密度较高，可以满足日常分析检测的要求。本研究所建立的高效液相色谱法简便、灵敏、准确、线性范围宽，适用于木脂素类化合物的分析。
