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【关键词】 盐酸
［摘要］ 目的 观测人胎盘碱性磷酸酶（HPAP）在盐酸胍变性和复性过程中构象与活力的变化，探讨其折叠机制。方法 应用荧光光度法检测HPAP构象变化,用分光光度法检测其活力的变化。结果 低浓度的盐酸胍(<0.5 mol/L)使酶的荧光强度略有下降，最大发射波长不变，仍为340 nm，酶活力增强；随盐酸胍浓度的增加，其荧光强度升高，最大发射波长明显红移，酶活力迅速下降；当盐酸胍浓度增至3.0 mol/L时，最大发射波长停止于365 nm，酶活力丧失，但其荧光强度在胍浓度增至5.0 mol/L时才停止变化。结论 HPAP在变性过程中存在三态；变性中间态酶可完全复性，而变性态酶仅部分复性，且与复性条件有关。
［关键词］ 碱性磷酸酶;盐酸胍;复性;变性
［ABSTRACT］ObjectiveTo examine the changes of conformation and activity of human placental alkaline phosphatase (HPAP) in denaturation and renaturation of guanidine chloride，and to study its folding mechanism.MethodsSpectrofluorimetry and spectrophotometry was used to determine the changes of conformation and activity of HPAP, respectively.ResultsThe fluorescence emission intensity of low concentration guanidine chloride (lower than 0.5 mol/L) decreased a little, without any red shift of emission maximum, and the wave length remained 340 nm, accompanied by a marked increase of HPAP activity. With the increase of guanidine concentration, fluorescence emission intensity increased, emission maximum shifted red and the enzyme was rapidly inactivated. At 3.0 mol/L, emission maximum was redshifted from 340 nm to 365 nm and the enzyme was completely inactivated. Fluorescence emission intensity stopped to increase at 5.0 mol/L.ConclusionA threestate unfolding mechanism is involved in the denaturation process. The intermediated state HPAP is completely refolding. The denaturated state HPAP is partially refolding and its refolding rate is related to refolding conditions.
［KEY WORDS］alkaline phosphatase；guanidine chloride；renaturation；denaturation
研究生物大分子的结构与功能是分子生物学的一个核心问题。对酶分子而言，其构象的完整对表现其活力是至关重要的。研究变性与复性过程中酶构象改变与活力变化的关系，是阐明酶的结构与功能、酶学性质及作用机制的有效方法；也可用这种方法研究肽链的折叠，即酶的复性过程，探讨酶的折叠机制。人胎盘碱性磷酸酶（HPAP）是通过寡糖磷脂酰肌醇锚在晚期胎盘细胞膜上的一种含巯基的金属糖蛋白，有显著的耐热性和化学稳定性，其溶解形式为二聚体，亚基相对分子质量为64 000，一级结构已基本确定［1,2］，其原级同工酶至少有4种类型，即小肠型、肝型、生殖细胞型及晚期胎盘型，它们分别由4个不同的基因位点所控制［3］。由于HPAP是一种新进化的基因产物，又是某些肿瘤的标志酶之一，故已对其进行了广泛的研究，但对其作用机制与生物学功能仍未完全阐明。研究HPAP的变性与复性、构象与活力之间的变化关系，将有助于其作用机制与生物学功能的阐明。
1 材料与方法
1.1 试剂
DEAE纤维素为上海试剂二厂产品；DEAESephadex A50为Pharmacia公司产品；Tris和盐酸胍均为Sigma公司产品；对硝基酚磷酸二钠（PNPP）为Merck公司产品；其他试剂均为国产分析纯，用双蒸水配制。
1.2 HPAP的分离纯化和纯度鉴定
HPAP的分离纯化按文献［4］的方法。纯化酶经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）鉴定为单一区带；反相高效液相色谱（HPLC）分析为单一对称峰。 测得纯化酶比活力为4.58 mol/(min・g)。 1期曾艳霞，葛银林，李馨，等盐酸胍对人胎盘碱性磷酸酶变性与复性的影响65
酶浓度用紫外吸收法测定。
1.3 酶的盐酸胍变性
变性体系中含52 mg/L酶，100 mmol/L(pH为8)TrisHCl缓冲液及一定浓度的盐酸胍，混匀，20 ℃保温24 h，使酶稳定,检测其构象与活力。
1.4 变性酶的复性
不同浓度的盐酸胍变性酶液在复性时使用100 mmol/L（pH 9）TrisHCl缓冲液稀释至盐酸胍浓度0.5 mol/L，复性温度4 ℃，复性时间24 h，检测其构象与活力。
1.5 酶构象的检测
用LS50型荧光光度仪测定变性酶和复性酶荧光发射光谱，激发波长为280 nm，激发和发射窄缝均为5 nm，测定温度为25 ℃，预保温15 min，检测300~410 nm荧光发射光谱，酶终浓度为13 mg/L，测定时用含相应浓度的盐酸胍缓冲液进行校正。
1.6 酶活力的测定
酶活力的测定按文献［5］的方法进行。测活体系中含有5 mmol/L PNPP，100 mmol/L（pH 8）TrisHCl缓冲液，2 mmol/L MgCl2及一定浓度的盐酸胍。于25 ℃条件下用岛津UV260型分光光度计测定，比色皿光径为1 cm，测定波长为405 nm。酶的终浓度为0.87 μg/L。在测定时，将测活体系于25 ℃预保温15 min，加入酶液后，混匀，检测其吸光度的变化，根据吸光度的变化值及生成对硝基酚的摩尔消光系数计算酶活力。
2 结 果
2.1 不同浓度盐酸胍对HPAP变性的影响HPAP的整个变性过程呈双相性变化，当盐酸胍浓度为0.5 mol/L时，变性平衡态酶的荧光强度略有下降，其最大发射波长与天然酶基本一致，均为340 nm，酶活力增加;当提高盐酸胍浓度，荧光强度增大，酶活力下降；当盐酸胍浓度为1.5 mol/L时，最大发射波长红移，酶活力迅速下降；当盐酸胍浓度增至3.0 mol/L时最大发射波长红移至最大，达到365 nm，此时酶完全失活,但荧光强度仍在继续增加，直至5.0 mol/L时才停止变化。见图1。
2.2 不同浓度盐酸胍对HPAP复性的影响
不同浓度盐酸胍对HPAP复性时构象与活力的影响，以天然酶的相对活力、荧光强度及最大发射波长作为对照。不同盐酸胍浓度的变性酶液经稀释复性后， 处于变性中间态的1、2 mol/L盐酸胍变性复性酶的荧光强度、最大发射波长及活力可基本恢复至天然态，复性酶的相对活力分别为99%和97%，其变性基本是可逆的;3 mol/L盐酸胍变性酶的复性酶相对活力迅速降低，仅为天然酶的27%,随着盐酸胍浓度的升高,变性酶的复性愈加困难,当盐酸胍浓度为6 mol/L时,变性酶不再复性。
图1 变性平衡态HPAP在不同浓度盐酸胍溶液中的荧光强度、最大发射波长与活力的变化
3 讨 论
HPAP在变性剂盐酸胍的作用下其变性过程呈双相变化，对HPAP的影响是一个复杂的过程。低浓度的盐酸胍微扰了酶活性部位的构象，使其由紧密的有序结构转变为松散的结构，解除了酶促反应中的限速步骤，此时酶的整体构象未发生变化,酶活力增加；由于酶活性中心具有柔性，活性中心内结合磷酸根解离为无机磷酸根有助于解除酶的限速步骤，增加酶的催化活性［6］。低浓度的盐酸胍可通过破坏负性协同力和加速结合磷酸根解离为无机磷酸根而增加酶柔性，有利于催化作用的进行，从而保持了酶的活性；上述作用随着盐酸胍浓度的增加而降低，酶活力随之逐渐下降；高浓度的盐酸胍扰乱了HPAP的整体构象，使酶活性部位的结构进一步松散破坏，最终导致酶活力的丧失；当盐酸胍浓度增至6 mol/L时，两亚基完全解离，肽链伸展，活性中心破坏，酶活力完全丧失。HPAP的双相变性也显示了变性过程存在3种状态,即天然态、变性中间态和变性态。具体而言，盐酸胍浓度<1 mol/L时，酶存在活性，甚至活性增强，此为天然态；盐酸胍浓度在1～3 mol/L时，酶活力迅速下降，为变性中间态；盐酸胍浓度>3 mol/L，酶活力完全丧失，为变性态。本文结果显示，整个变性过程中HPAP出现了3个状态的演变，即天然态、变性中间态和变性态。天然态时酶活性中心受到盐酸胍的微扰，活性中心的构象发生变化，使得其结构更有利于催化作用的进行，酶活性增强；变性中间态时荧光强度及最大发射波长出现较大变化，这个阶段酶的构象处于剧烈变化中，酶活力迅速下降；变性态时酶的两亚基解离，肽链伸展,整体结构遭到破坏，酶活力完全丧失。此外变性过程中出现的荧光强度增强可能是由于酶蛋白肽链的伸展，使得酶分子内部的Tyr和Trp残基由疏水环境暴露到亲水环境后共同作用的结果；而荧光发射峰位的红移则是荧光能量淬灭所致。复性缓冲液中低浓度盐酸胍可通过减少解离亚基间的聚集来促进酶的复性［7］，此时盐酸胍对酶的作用小于酶分子恢复天然稳定构象的能力，酶分子发生构象的复性与活力的恢复。实验显示,变性中间态在此条件下可完全复性，而变性态不能复性，其原因可能是变性中间态时酶的构象正处于剧烈变动之中，给予其合适的复性条件，它即可自发地正确折叠；变性态时两亚基解离，肽链处于完全伸展状态,在折叠过程中就会出现大量的错误折叠，二硫键的错误配对和分子间的集聚等，导致其不能复性。在稀释法复性中，变性中间态酶可完全复性，而变性态酶仅部分复性，且随盐酸胍浓度增大,变性态酶的复性愈加困难。按照ANFINSEN提出蛋白质一级结构决定其空间结构及生物学功能的学说，变性态酶从理论上讲也可以完全复性，但需要充足条件,如何使HPAP完全复性有待进一步探讨。
［参考文献］
［1］NOSJEAN O, KOYAMA L. Human tissue nonspecific alkaline phosphatase:sugarmoietyinduced enzyme and antigenic modulations and genetic aspecta［J］. Biochem, 1997,321:297.
［2］HARRIS H. The human placental alkaline phosphatase: what we know and what we do not know［J］. Clin Chim Acta,1989,186:133.
［3］ MILLAN J L. Molecular cloning and sequence analysis of human placental alkaline phosphatase［J］. J Biol Chem，1986,261(7):3112.
［4］耿芳宋.人类胎盘碱性磷酸酶的分离纯化［J］.青岛医学院学报,1998,34(2):84.
［5］MIGGIANO G A D, MORDENTE A. Early conformational changes and activity modulation induced by guanidinium chloride on intestinal alkaline phosphatase［J］. Biochem,1987,284:551.
［6］HUANG T M, HUNG H C,CHANG T C. Solvent kinetic isorope effects of human placental alkaline phosphatase in reverse micelles［J］.Biochem, 1998,330:267.
［7］陈素丽.在胍溶液中文昌鱼酸性磷酸酶活性部位的构象变化与活力变化的关系［J］.厦门大学学报:自然科学版,1997,36(3):419.
