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大黄虫片由熟大黄、土鳖虫、水蛭、白芍等12味中药组成,具有活血破瘀、通经消痞功效,用于瘀血内停,腹部肿块,肌肤甲错,目眶黯黑,潮热羸瘦,经闭不行。本试验采用高效液相色谱(HPLC)法测定大黄虫片中芍药苷的含量,可更好地控制该制剂的质量。
1 仪器与试药
Agilent1100系列高效液相色谱仪：G1311A四元泵, G1313A自动进样器,G1379A脱气机,G1314VWD检测器, Agilent1100化学工作站；UV-2201型紫外-可见分光光度仪； BUG40型超声波清洗发生器。
大黄虫片及不含白芍药材的阴性对照品(广西玉林制药有限责任公司技术中心提供)；芍药苷对照品(批号110736- 200628,供含量测定用,中国药品生物制品检定所提供)。乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯。数学论文发表
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)[1],流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长为230 nm,进样量为10 μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取芍药苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL含芍药苷40 μg的溶液,作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
取本品20片,研细,精密称取2 g,置锥形瓶中,加稀乙醇50 mL,超声提取(功率220 W,频率50 Hz) 40 min,放冷,过滤,蒸干。残渣加稀乙醇适量使溶解,通过中性氧化铝柱(100～200目,4 g,内径15 mm),以稀乙醇洗脱,收集洗液50 mL,蒸干,残渣用稀乙醇溶解,并转移至20 mL量瓶中,用稀乙醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。
2.2.3 阴性对照溶液的制备
按处方比例和工艺,制成不含白芍药材的阴性对照品,按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液并测定。
2.3 空白试验
按上述色谱条件,吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL,分别注入液相色谱仪进行测定。在与对照品色谱相应的位置上,供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰,而阴性对照在此保留时间无干扰(见图1)。数学论文发表
2.4 线性关系考察
精密称取芍药苷对照品,加甲醇制成浓度分别为10.0、20.0、30.0、40.0、60.0、90.0 μg/mL的系列溶液,分别进样10 μL,在上述色谱条件下测定峰面积。以芍药苷的进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程为：Y＝
2 437.0X＋35.1,r＝0.999 7,表明芍药苷进样量在0.10～0.90 μg范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
精密吸取芍药苷对照品溶液(40 μg/mL)10 μL,按上述色谱条件,分别连续进样6次,测定峰面积,结果芍药苷峰面积的平均值为1 036.86,RSD＝0.91%,表明本法精密度良好。
2.6 重复性试验
取同一批号(批号为860003)样品,按供试品溶液的制备方法平行制备6份,按上述色谱条件进行测定。结果芍药苷含量的平均值为0.292 3 mg/片,RSD＝1.68%。表明本法的重复性良好。
2.7 稳定性试验
取同一批号(批号为860003)样品,按供试品溶液制备方法制备,按上述色谱条件,分别在0、2、4、6、8、10 h进样1次,测定峰面积,结果芍药苷峰面积的平均值为1 238.26,RSD＝1.45%。表明供试品溶液在10 h内基本稳定。 数学论文发表
2.8 加样回收率试验
取已知含量的同批号(批号为860003,含量0.291 mg/片)样品约1 g,精密称取6份,分别精密加入芍药苷对照品适量,按供试品溶液制备方法制成供试品溶液,按上述色谱条件测定,计算。结果芍药苷的平均回收率为99.98%,RSD＝0.81%。见表1。表1 加样回收率测定结果（略）
2.9 样品测定
取样品约2 g,精密称定,照“2.2.2”项下方法制成供试液,精密吸取10 μL注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定,以外标法计算样品中芍药苷的含量,结果见表2。表2 芍药苷含量测定结果（略）
3 讨论
芍药苷对照品甲醇溶液在紫外分光光度计扫描下,最大吸收波长为230 nm,故选定230 nm为检测波长。
在供试品溶液的制备中,曾采用甲醇、75%乙醇、稀乙醇作为溶剂,对超声和回流提取进行了比较试验。结果表明,采用稀乙醇超声提取与采用稀乙醇回流,测得的含量高且一致,但超声处理方法简单快速,故选用稀乙醇超声处理直接提取样品。同时进行了超声提取时间的考察,分别超声30、40、50、60 min,结果超声40 min可基本提取完全。在用稀乙醇洗脱时,曾收集洗液40、50、60、80 mL进行比较试验,测得的含量表明,收集洗液50 mL已洗脱完全。
本试验曾使用乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液等不同比例作流动相进行测定,结果表明,以乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)作流动相,芍药苷峰与其他杂质峰较好分离。数学论文发表
本试验采用HPLC法对大黄虫片中芍药苷进行了含量测定,方法简单,易于操作,分离效果好。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.68－69.
