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-连锁无丙种球蛋白血症的研究进展
-连锁无丙种球蛋白血症的研究进展 【摘要】X-连锁无丙种球蛋白血症（X-linkedagammaglobulinemia，XLA） 属于原发性体液免疫缺陷病中的一种，又叫Bruton病。近年来，由于Bruton酪氨 酸激酶（Bruton’sagammaglobulinemiatyrosinekinase，BTK）基因突变导致B细胞 发育障碍，所以不能产生免疫球蛋白。本文就近年来对BTK的遗传学特性、基因 突变分析、分子致病机制及诊断和治疗等的研究进展作一综述。【关键词】X-连锁无丙种球蛋白血症（XLA）；
Burton酪氨酸激酶（BTK）；
诊断；
治疗 【Abstract】X-linkedagammaglobulinemia（XLA） belongstotheprimaryimmunodeficiencydisease（PID）， whichcallsBrutondisease.Recently，itcannotgenerateimmuneglobulin， becauseofthemutationoftheBruton’sagammaglobulinemiatyrosinekinase（BTK）gene， whichleadstodevelopmentaldisorderoftheBcell.Thisarticlereviewsthegeneticcharacters， mutationanalysis，molecularpathogenicmechanismandtherapyoftheBKTgene. 【Keywords】XLA；
BTK；
diagnosis；
therapy X连锁无丙种球蛋白血症（X-linkedagammaglobulinemia，XLA），又称 Bruton无丙种球蛋白血症，是最早发现的人类原发性免疫缺陷病 （primaryimmunodeficiencydisease，PID）之一，Bruton（1952年）首次报道。患 者临床上以反复细菌感染为特征，血清中各类免疫球蛋白明显降低或缺乏，对抗 原刺激不能产生抗体应答，血循环中B淋巴细胞减少，淋巴结及淋巴组织缺乏生 发中心和淋巴滤泡，骨髓中无浆细胞，但前B淋巴细胞数量正常，T淋巴细胞数 量及功能正常。典型病例为出生后半年左右开始反复化脓感染（如肺炎链球菌或 嗜血流感杆菌）或迟至幼年发病，患者体内缺少成熟B细胞，基本上不能自主产 生免疫球蛋白，必须依靠免疫替代疗法维持体液免疫水平。该病严重危害患者健 康，危及患者生命。80%～90%［1］临床诊断病例可检出相关致病基因BTK发 生突变，而其他10%～20%［1］的病人存在其他问题，有研究显示常染色体编 码Igφ［2，3］、μHC［4］和LC的基因存在突变。
1BTK的遗传学特性大多数PID的遗传形式已经明确，几乎均为单基因遗传， 多数为常染色体隐性遗传，其次为X连锁隐性和常染色体显性遗传。大多数情况 男性发病，女性携带，但也有男性携带者不发病的报道。60%的PID突变基因的DNA序列已被克隆，突变位点（包括突变基因定位的染色体节段和基因位点） 和突变形式（单个核苷酸缺失、替代、插入、移码突变、无义或错义突变等）也 已确定［5］。在WHOPID专家委员会的指导下，成立了有关疾病基因库，记录 登记全球范围的PID基因突变及其类型。多基因遗传性PID的确定较困难，至今 尚无确切的报道。
1.1BTK的蛋白结构BTK蛋白为B细胞信号传递系统中的重要蛋白，属于非 受体型蛋白酪氨酸激酶Tec家族的一员，该家族的成员还包括TEC、ITK/TSK/EMT 和BMX。Tec家族蛋白酪氨酸激酶包括5个不同的结构区段（见图1），从N末端 起为PH（pleckstrinhomology；
PH）段，约有120个氨基酸，TH（Techomology；
TH）段约有60～80个氨基酸SH3（Srchomology3;SH3）段约有60个氨基酸，SH2 段约100个氨基酸，激酶催化段约280个氨基酸［6］。
图1BTK蛋白的组成（从N端开始）包括5个区域：PH、TH、SH3、SH2 和激酶区。
注：图上边的数字代表各段的氨基酸长度，图下边的数字代表不同的外显 子及其相应的位置。
BTK蛋白的空间结构多数已测明，包括PH区、TH区的前半部、SH3区和 激酶催化区［7］，SH2区的结构可借用其他蛋白激酶的类似结构进行研究。这 些三维空间结构可用于分析突变造成的蛋白空间结构的改变。
1.2BTK基因的分子结构及其突变分析在20世纪80年代，多位学者应用 DNA多态性标志分析的方法，成功地将XLA的缺陷基因定位于X染色体中部 （Xq21.3-22）的2cm区域内［8］。Vetrie等用定位克隆方法在XLA病变基因区内 分离鉴定了一个新的基因，该基因表达于正常人各期B淋巴细胞，在XLA患者中 发生突变，故认为是XLA的致病基因。Tsukada等也找到XLA的KD致病基因。BTK 基因全长37.5kb，含有19个外显子，除第一外显子外，其余18个编码BTK蛋白的 659个氨基酸，分子量为76KD［9］。cDNA含有2560个核苷酸，有一个编码659 个氨基酸多肽的开放阅读框架，起始密码子在核苷酸第133位置上，在起始位置 上游的15个密码子处阅读框架闭合。根据国际研究小组BTK突变分析，迄今已经 在471个家族544个XLA病人中发现了BTK基因341个独立存在的碱基置换、插入 或缺失，其中有13个大段缺失和2个大段插入。突变不仅存在于19个外显子，还 涉及内含子和启动区域。其中，发生频率最高的是错义突变，其次是无义突变和 拼接位点突变。错义突变主要发生在三联体密码子的前两位。外显子8和9的185~287位没有错义突变，这些位点可能不易突变或是功能上不重要。33%的替 代累及CPG双核苷酸，这是目前认为的最常见的突变热点［10］，而突变高频位 点R520也属于CPG突变［6］。编码外显子蛋白突变的区域［11］（见表1）。表 1编码外显子蛋白突变的区域 2BTK的分子致病机制BTK属于非受体酪氨酸蛋白激酶，该类激酶广泛参 与细胞信号传导，影响细胞的存活、增殖和分化，BTK是B细胞发育成熟的关键 因素。正常人除T细胞和浆细胞外均有BTK表达，而BTK基因突变只影响B细胞 的数量，这说明BTK在B细胞的生长发育过程中起着至关重要的作用。目前对 BTK参与细胞信号传导研究比较清楚的是BCR交联介导的信号传导途径。其过程 简述如下：BCR交联激活Pl-3激酶并产生一定数量的Pl-3，4，5-risphosphate与膜 结合，Pl-3，4，5-risphosphate与BTK的SH3段作用使其定位于细胞膜。然后，BTK 经过两步活化：首先BTK激酶段Y551位磷酸化（很可能是与Lyn作用），接着是 SH3段Y223位的自身磷酸化。活化后的BTK与B细胞衔接蛋白（BLNK）结合并 激活phospholipaseC-γy（PLC-γ），导致钙离子通道打开，胞外钙离子内流。该 信号传导途径最终导致细胞增生加强和转录的变化。此模式仅限于以B细胞受体 交联作为刺激信号，至于前B细胞受体交联是否也引起相同的信号传导目前还缺 乏证据［1，12］。该信号传导途径受FcRⅡB和SHIP （SH2-containinginositol-5-phosphatase）磷酸酶介导的另一途径制约，通过水解 Pl-3，4，5-risphosphate和Ins（1，3，4，5）-etraphosphate关闭钙离子内流通道 ［13］。BTK不仅可以由BCR和FCR介导激活，也可以通过其他很多受体激活， 包括G-protein-coupledreceptors（GPCR）、IL-3、IL-5和IL-6，另外，CD19和单 克隆抗体的交联也可激活BTK［13］，近年来研究表明，CD40也是B细胞发育过 程中的重要受体，传递刺激信号影响细胞存活、生长和分化。与BCR介导的BTK 活化途径相似，CD40的交联也可激活BTK。CD40和BCR可能是B细胞发育过程 中不同阶段激活BTK的信号传递通路。但也有研究提示CD40不通过BTK也可提 高NFKB和JNK的水平，是独立于BTK的信号传导通路［14～16］。BTK在细胞 内与很多分子相互作用，共同构成了一种微环境，在信号传导的过程中起着重要 的作用。这些分子分别与BTK的不同区段相互作用，其中与PH段作用的分子研 究得很多，R28附近区域与PIP3、IP4、PKCβⅠ、BP-135、F-ac-tin、STAT3和Fas 作用。PH-TH区域与Gαq和Gβ双体作用;SH3与c-Cb1、WASp、Vav和sab作用;SH2 与磷酸化的BLNK作用。另外，SH3与TH在BTK分子内作用，抑制BTK的活性。
在BCR交联介导的信号传导途径中，Syk和BLNK对BTK的活化起正向调节作用， 磷酸化的PKCs、sab和IBTK对BTK的活化有抑制作用。尽管与BTK作用的分子很 多，但是它们如何协调地与BTK作用，完成BTK参与的信号传导，机制目前尚不清楚［17，18］。
3XLA的诊断XLA是一种原发性体液免疫缺陷症，危害着人们的健康。因 而，对该症进行产前诊断和女性携带者的鉴定就显得十分重要［19］。为了研究 XLA家系女性成员的情况，Fearon等采用了X染色体失活的方法去发现携带状况 以及验证B淋巴细胞发育的内在缺陷。根据这一方法用重组DNA探针同时发现 RFLP和X染色体基因甲基化。在无携带状态的女性的外周血粒细胞、T淋巴细胞 和B淋巴细胞中发现X染色体的随机失活。相反，该症的三个携带者在外周B淋巴 细胞两个X染色体中的一个优先失活，但不是T细胞或粒细胞。这一发现强烈地 支持XLA是由B淋巴细胞发育的内在缺陷所致的假设。Lovering（1994）等［20］ 对BTK基因缺失患者DNA分子斑点杂交分析见到了已改变的DNA限制性片段， 并对7个患者家庭用已经改变的限制性片段方法对与患者有关的女性携带状况作 出诊断。随后，Schuster等［21］报道了对所有19个外显子。包括侧翼内含子边 界采用PCR-SSCP方法成功地检测到两例男性患儿BTK的SH2功能区的新突变， 并用一个已改变过的第一个引物做PCR扩增突变发生，作出三代中健康女性携带 者的鉴定。接着，Hagemann等［22］对一个散发的XLA患儿及家庭的三代成员 应用PCR扩增基因组DNA，采用序列分析的方法直接鉴定XLA的基因突变，结果 诊断出患儿及其免疫学表现正常的女性携带者。以上这些方法均可应用于产前诊 断。这无疑对优生优育是很有意义的。
4XLA的治疗研究免疫重建是采用正常细胞或基因片段植入患儿体内，使 之发挥功能，以持久地纠正缺陷的基因及其表达产物。1968年使用HLA配型同种 异体骨髓移植治疗2例致死性免疫缺陷病获得成功。至今已有近2000例PID患儿接 受骨髓移植，总存活率为62%，其中同型合子骨髓移植达79%。无关供体配型骨 髓（matchedunrelatedmarrowdonor，MUD）移植在近年已很盛行，成功率约为50%， 5岁以内接受移植者可达85%［23］。近年开展脐血干细胞移植，存活率为75%。
用母体骨髓CD34+干细胞宫内移植（腹腔注射）已有成功的报道［5］。将正常 目的基因片段整合到患儿干细胞基因组内（基因转化），随细胞有丝分裂，转化 的基因片段能在患儿体内复制而持续存在。理论上讲，凡能通过骨髓移植治愈的 疾病均是基因治疗的指针［24］。基因治疗PID的尝试已经历多年，取得一定成 效，但尚处于探索和临床验证阶段［25］。Faust等［26］的动物实验是通过免 疫球蛋白的增强子和驱动子介导的小鼠BTKcDNA转录至两组免疫缺陷鼠（XLD 或BTK-/-鼠）。转入1个拷贝的XLD或BTK-/-鼠经蛋白印迹法检测其BTK达到正 常量的25%；
而转录2个拷贝者其BTK达到正常量的50%。两组小鼠经检测均有 正常数量的脾B细胞，两组小鼠对TNP一蔗聚糖刺激所产生抗体的反应和血清IgM、lgG3水平较正常野生鼠明显减低，但较XID小鼠有所提高。Drabek等［27］ 通过人类BTKcDNA与鼠主要组织相容性复合体Ⅱ区调节因子的转基因治疗，纠 正了BTK缺陷鼠的B细胞功能，并发现转入的基因并不表达于前B细胞以前的分 化阶段，此外它在胸腺上皮细胞、活化T细胞、单核细胞上表达，并在其他组织 均有低水平表达。经蛋白印迹法检测转基因鼠的脾细胞产物发现，BTK蛋白总含 量可达到与野生型鼠相同。这些研究均向我们提供了基因治疗XLA的可能性。此 外，Rohrer等［28］通过动物实验证实，应用极少量正常骨髓细胞输注即可通过 竞争使XID小鼠获得B系统免疫重建。这项研究推测，即使不成功的基因治疗也 可对XLA患者有益，为今后开展人类XLA的基因、细胞治疗提供有利的基础和广 阔的前景。总体上说，尽管目前基因治疗离成熟的临床治疗技术还有相当的距离， 但经过近10年的临床试验，人们已获得了大量宝贵的临床资料。我们有理由相信， XLA的基因治疗将在不久的将来获得突破性进展。
5展望尽管80%～90%临床诊断为XLA的病人依靠BTK突变检测确诊为 XLA，但是XLA的基因突变位点很多，与临床症状的相关性不强，同一家系中的 XLA病人临床表现程度很可能各不相同。即：基因型和临床表型的关系是目前需 要研究的课题之一［29］。这涉及到突变基因产物蛋白质的功能、结构稳定性和 二维构像［30，31］。这样，通过基因突变及其对蛋白的影响无法预知XLA的病 程、复杂程度、B细胞数量和免疫球蛋白的水平。只有彻底明确BTK在B细胞信 号传导中的作用机制，才能找到基因突变和临床症状的相关性，完善XLA的基因 诊断，并为治疗奠定理论基础［32］。1994年，国际上成立了BTK基因突变分析 小组并建立了BTK基因突变数据库（http：//www.uta.fi/imt/bioinfo/btkbase/），为 XLA的基因诊断提供了便利的条件。但是数据库中的病源主要来自西方国家、日 本和俄罗斯，而国内的BTK基因研究相对处于空白阶段。因此，目前开展BTK 基因突变的检测工作应成为国内同类研究的重点，通过建立有效可靠的BTK基因 突变筛查方法，研究中国人BTK基因突变的规律。因此，随着对PID认识的深入 和检测方法的简化，将会有更多的病例被确诊，不仅可以用常规方法治疗，而且 可以做基因分析，同时，建立PID登记网络［33］，也将有助于了解确切的发病 率和需要治疗的患者。总之，来自突变基因的BTK蛋白还没有被完全认识，在蛋 白质水平这些突变的结果还不清楚。BTK基因突变在XLA发病机制中更详细作用 还不清楚，但作为疾病基因，对其基因组结构的研究，将为未来的体细胞基因治 疗创造条件。当然，体细胞治疗存在着一定的问题，目前还不能达到此目的，但 这是今后研究的一个重要方向，基因治疗无疑是近20年来分子生物学和重组 DNA技术迅速发展的一种结果。由于体内大剂量静脉丙种球蛋白的长期替代疗 法有不少的副作用，且价格昂贵，不能根本解决问题。若能将缺陷的基因进行原位的修补，基因治疗将是最理想的根治方法。
