I。 [硬膜外应用虎纹镇痛肽I对自体神经移植大鼠脊髓背角cfos表达的影响]

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【摘要】　　目的通过观察硬膜外给予虎纹镇痛肽I对大鼠自

体神经移植模型机械痛阈与脊髓背角cfos表达的影响，探讨虎纹

镇痛肽I对再生神经神经性疼痛的影响。方法雄性Wistar大鼠60

只随机分成A、B、C组，A组为自体神经移植模型组；B组为自体神

经移植模型加虎纹镇痛肽I治疗组；C组为假手术组。分别制成模

型后，术后27 d起检测机械刺激阈值及cfos表达计数。结果 A、

B组各项指标与C组比较有显著差异；A组与B组比较cfos表达阳性

细胞计数及机械痛阈均有显著差异。结论虎纹镇痛肽I能有效减

轻再生神经的神经性疼痛程度，促进神经的完善修复。

【关键词】周围神经损伤；神经再生；神经性疼痛；cfos；虎

纹镇痛肽I

Abstract: Objectives To investigate the influence of

huwena analegesic peptideI (HWAPI) on neuropathic

pain of the regeneration nerve by observing the machinery

pain threshold and cfos expression in sciatic nerve

autograft rat model after applying HWAPI epidurally.

Methods Totally 60 male Wistar rats were randomly pided

into three groups: sciatic nerve autograft group (group

A), sciatic nerve autograft with treatment of HWAPI

group (group B) and sham group (group C). The machinery

pain threshold and cfos expression were measured 27 days

after the operation. Results All indicators in group A

and B were significantly different from those in group C.

Remarkable differences in machinery pain threshold and c

fos expression were also existed between group A and B.

Conclusions Appling HWAPI epidurally can significantly

alleviate neuropathic pain of the regeneration nerve and

promote its recovery.

Keywords: peripheral nerve injury; regeneration;

neuropathic pain; cfos; HWAPI

虎纹镇痛肽I(huwena analgesic peptideI，HWAPI)是

从珍稀毒蜘蛛虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化的一种多肤类神经毒素，

由33个氨基酸构成，是一种作用于突触前膜的N型钙离子通道阻

断剂，无成瘾性，可阻断中枢的痛觉传导[12]。本实验通过观察

硬膜外应用虎纹镇痛肽I对大鼠坐骨神经自体神经移植模型的机

械刺激阈值和脊髓背角cfos表达的影响，探讨虎纹镇痛肽I对

外周神经再生中神经性疼痛的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 分组及模型制备

雄性Wistar大鼠60只（解放军武汉总医院动物实验中心提供）

，体重180～200 g，随机分成Ａ、Ｂ、Ｃ组。A组为坐骨神经自体

神经移植模型组；B组为坐骨神经自体神经移植模型加虎纹镇痛肽

I治疗组；C组为假手术组。所有大鼠均在标准条件下（标准温度

、湿度、12 h明暗周期，可自由摄食摄水）饲养。首先对B组行硬

膜外插管，切开大鼠颈后部皮肤，依次分离肌层，暴露出寰枕膜，

用五号针挑开寰枕膜与第一颈椎之间的筋膜，但不挑破寰枕膜，然

后将PE10聚乙烯管插入硬膜外腔，插入深度为7 cm，到达脊髓腰

膨大水平。在管的中段预先用封口膜缠一小结球以确定插入深度，

缝合小球固定在颈背肌，通过留在外面的PE10进行给药[3]。B组

观察1周后，三组大鼠行坐骨神经自体神经移植模型制备。1%硫喷

妥钠5～7 mg/kg腹腔注射麻醉后，大鼠俯卧，右股后外侧纵行切口

，自肌间隙进入，分离出右侧坐骨神经，于坐骨神经中段、胫神经

和腓总神经分叉近端操作。A组及B组分离出右侧坐骨神经后于坐骨

神经中段，胫神经和腓总神经分叉近端切取神经10 mm，即用9/0无

创伤缝线显微镜下行原位神经移植；C组坐骨神经仅于空气中暴露5

min后，还复至原位，术毕逐层关闭切口。所有手术操作均在SXP

1型显微镜（上海医用光学仪器厂生产）下进行。术后常规注射青

霉素抗炎治疗，分笼饲养。B组模型制备术后6 h起每天硬膜外给予

HWAPI 50 μg/kg，持续1周。

　　1.2 机械痛阈测试

模型制备术后27 d起，进行不同强度的Von Frey丝痛阈测试，

每3 d测定1次，每组每次随机挑选5只大鼠，由患肢2、3跖趾间皮

肤敏感处进行测试，每根Von Frey丝重复5次，每次间隔2 s，出现

3次以上的缩爪反应，记为该足1次机械痛阈值。各大鼠左右足轮流

测试，每足测试5次，各取其平均值，为其机械痛阈值。术前各组

均测定机械痛阈值。

　　1.3 cfos检测

各组大鼠术后27 d起每6 d检测，每组测痛剩余大鼠中随机挑

选5只大鼠，患侧足底均给予轻柔触摸刺激，3 h后予腹腔注射1%硫

喷妥钠10～15 mg/kg深麻醉后，心脏灌注生理盐水，再以4%多聚甲

醛300 mL心内灌注固定。取脊髓L4～L6节段，置于相同固定液中固

定24 h，石蜡包埋、切片，以免疫组织化学SP法检测cfos表达。

显微镜下观察fos阳性反应性神经原个数。每只大鼠取5张fos蛋白

表达最多的切片，对术侧脊髓背角I～II层fos蛋白阳性表达细胞进

行计数统计。

　　1.4 统计学处理

用SPSS 11.0软件进行统计分析，所有计量资料采用均数±标

准差(±s)表示，组间比较采用配对t检验，组间采用单因素方差分

析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

术前各组机械刺激阈值无差异。A、B组术后均表现为右后肢拖

行，右后肢肌肉萎缩及关节僵硬；C组大鼠术后右足承重基本恢复

。

　　2.1 机械痛阈测定

A、B两组术后机械痛阈与基础痛阈比较均有显著差异，P<0.05

。A、B两组机械痛阈与C组比较均有显著差异，P<0.05。C组机械痛

阈与基础痛阈比较无差异，P>0.05。A组术后45 d机械痛阈与27 d

比较显著升高，P<0.05。B组术后45 d机械痛阈与27 d比较显著升

高，P<0.05。B组机械痛阈较A组低，P<0.05。见表1。表1 机械刺

激退缩阈值(略)

　2.2 fos蛋白阳性细胞计数

A、B组计数与C组比较均有显著差异，P<0.05。A组组内比较，

术后45 d和27 d的计数比较有统计学差异，P<0.05。B组组内比较

，随时间进展fos蛋白阳性细胞计数有下降趋势，但45 d和27 d的

计数比较无统计学差异，P>0.05。A、B组间比较fos蛋白阳性细胞

计数差异显著，P<0.05。见表2。表2 脊髓背角cfos表达阳性细

胞计数(略)

　　3 讨论

坐骨神经自体神经移植模型再生神经生长进入去神经支配区域

时，触觉可诱发疼痛和脊髓背角浅层cfos表达及疼痛相关行为。

重复触觉刺激引起脊髓背角浅层cfos表达明显增高和机械痛阈稳

定和明显的降低，说明被损神经再次支配靶器官，但感觉功能没有

正常恢复。伴随着感觉功能恢复，动物表现出机械痛觉超敏状态[4

7]。而本实验结果表明应用虎纹镇痛肽I组fos表达阳性细胞数

及机械刺激退缩阈值均有显著差异，显示应用虎纹镇痛肽I能明

显减轻再生神经的神经性疼痛。

神经元钙通道的主要作用是调控去极化诱导的Ca2+内流。Ca2+

内流可以触发细胞内Ca2+依赖的一系列生理反应，包括神经元兴奋

性的调节、神经递质释放、激活第二信使和基因转录等[8]。其功

能主要为触发神经递质释放，这些物质包括：谷氨酸、乙酰胆碱、

去甲肾上腺素、多巴胺、γ氨基丁酸、P物质及降钙素基因相关

肽等，其中谷氨酸和P物质与疼痛关系最为密切。谷氨酸作用于突

触后膜NMDA、AMPA、海藻酸受体及代谢型谷氨酸受体，P物质作用

于突触后膜神经激肽1受体，通过开放偶联的阳离子通道，以及G

蛋白、蛋白激酶C、一氧化氮、Ca2+等参与的一系列胞内信号转导

过程，介导痛觉通路的兴奋性突触传递，从而将外周伤害性信息传

入高位中枢，产生痛觉。

N型钙通道主要分布于疼痛传递与调控通路的神经元突触末

梢[9]，但在背根神经细胞以及脊髓背角神经的突触末梢分布最为

密集。这些初级传入神经（主要是C纤维和Aδ纤维）在感受各种

伤害性疼痛刺激包括热伤害、机械伤害以及炎性疼痛刺激中具有重

要作用。研究表明，阻断N型钙通道后对急性热疼痛效果不明显

，而对炎症性和慢性神经病理性疼痛效果较明显[10]。

研究发现轴突再生中可能发生形态学和基因表达变化[1112]

，外周神经损伤后功能可能不是恢复为正常，而是表现出功能和结

构上的改变，并在再生过程中持续下来。本实验表明硬膜外应用虎

纹镇痛肽I能有效减轻再生神经的神经性疼痛，促进再生神经功

能的完善与恢复，其对外周神经损伤的神经功能和结构影响的具体

机制有待进一步研究。

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