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降压益肾颗粒由鬼针草、何首乌、川牛膝等6味中药组成,其对原发性高血压及高血压早期肾损害有明确的降压及肾脏保护作用。为了控制该制剂的质量,我们对其进行了定性定量研究。根据处方中各药材所含成分及其理化性质,用薄层色谱法对制剂中的鬼针草、何首乌、川牛膝、山茱萸、泽泻、玄参进行了定性鉴别,采用高效液相色谱法对方中何首乌中的2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷进行定量研究。 职称论文发表网
1 仪器与试药
Agilent1100高效液相色谱仪：四元泵(G1311A)；柱温箱(G1316A)；VWD检测器(G1314A)；紫外检测器软件：Agilent Chemstation；939型全自动薄层制板器(重庆市南岸贝尔德仪器技术厂)；101-1A型电热鼓风干燥箱(南通沪通制药机械设备厂)；数显恒温水浴锅HH-4(国华电器有限公司)；WD-9413A凝胶成像分析仪(北京市六一仪器厂)；1/10万电子分析天平(BP-211D型,德国Sartorius)；玻璃点样毛细管(华西医科大学仪器厂生产)。
硅胶G(青岛海洋化工集团)；2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷对照品(含量测定用,批号0844-20003,购自中国药品生物制品检定所)；降压益肾颗粒(批号080102、080103、080104,江苏省中医院制剂部提供)。薄层色谱所用试剂均为分析纯,高效液相色谱所用试剂为色谱纯,水为超纯水。
2 薄层色谱鉴别
2.1 鬼针草
取本品约5 g,加水15 mL溶解,超声30 min,滤过,滤液加乙酸乙酯萃取2次,每次15 mL,合并萃取液,水浴蒸干,残渣加甲醇2 mL溶解,作为供试品溶液。同法制备阴性供试品溶液。取鬼针草对照药材粉末3 g,同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以苯-乙酸乙酯(1∶2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%AlCl3乙醇溶液,105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材相应位置上,显相同颜色的斑点,而阴性供试品在相应的位置上无此斑点。
2.2 何首乌
取“2.1”项下制备的供试品溶液,同法制备阴性供试品溶液。取何首乌对照药材粉末1 g,同法制成对照药材溶液。吸取供试品及阴性样品溶液各10 μL、对照药材溶液5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以苯-乙醇(3∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,氨蒸气显色,日光下检视。供试品色谱中,在与对照药材相应位置上,显相同颜色的斑点,阴性供试品色谱在相应的位置上无此斑点。 职称论文发表网
2.3 川牛膝
取“2.1”项下制备的供试品溶液,同法制备阴性供试品溶液。取川牛膝对照药材1 g,同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯(20∶5∶8)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的荧光斑点,而阴性供试品在相应的位置上无此斑点[1]。
2.4 泽泻
取“2.1”项下制备的供试品溶液,同法制备阴性供试品溶液。取泽泻对照药材2 g,同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各20 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-丙酮(4∶3∶2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%香草醛浓硫酸试液。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的紫色斑点,而阴性供试品在相应的位置上无此斑点[2]。
2.5 山茱萸
取“2.1”项下制备的供试品溶液,同法制备阴性供试品溶液。取山茱萸对照药材2 g,同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶16∶2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇试液。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,而阴性供试品在相应的位置上无此斑点。
2.6 玄参
取本品约5 g(约相当于玄参药材2.5 g),加水15 mL溶解,超声30 min,滤过,滤液加乙酸乙酯萃取2次,每次15 mL,合并萃取液置蒸发皿中,水浴蒸干,残渣加30%乙醇15 mL溶解,加于已处理好的D101大孔树脂柱,先用30%乙醇液洗脱,再用稀乙醇洗脱,收集稀乙醇洗脱液,水浴蒸干,甲醇溶解定容至1 mL,作为供试品溶液。同法制备阴性供试品溶液。取玄参对照药材7.5 g,加水15 mL溶解,超声30 min,滤过,滤液加乙酸乙酯萃取2次,每次15 mL,合并萃取液置蒸发皿中,水浴蒸干,残渣加甲醇2 mL溶解,作为供试品溶液。吸取供试品及阴性样品溶液各10 μL,对照药材溶液5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲酸-水(15∶4∶2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%香草醛浓硫酸试液。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,而阴性供试品在相应的位置上无此斑点[3]。
3 含量测定
3.1 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18柱；VWD检测器；流动相为乙腈-水(18∶82)；流速1 mL/min；检测波长320 nm；柱温30 ℃；理论板数按2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷峰计不低于3 000,进样量10 μL[4]。 职称论文发表网
3.2 对照品溶液的制备
精密称取2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷对照品13.05 mg,加50%甲醇溶解,制成每1 mL含0.522 mg的对照品溶液。
3.3 供试品溶液的制备
取降压益肾颗粒粉末0.4 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入稀乙醇25 mL,称定重量,超声处理30 min,放冷,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,上清液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液作为供试品溶液(避光操作)。同法制备阴性供试品溶液。分别精密吸取对照品、供试品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定,色谱图见图1。
3.4 线性关系考察
取上述对照品溶液,用流动相分别稀释为52.2、26.1、13.05、6.525、3.262 5、1.631 3 μg/mL的对照品溶液,分别精密吸取各不同浓度的对照品溶液10 μL,注入高效液相色谱仪中测定。经线性回归,得回归方程Y＝45.448X－27.934,r＝0.999 9,表明2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷在0.016 3～0.522 μg范围内呈良好的线性关系。
3.5 精密度试验
取同一批号2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷对照品溶液,进样量10 μL,重复测定6次,以峰面积计算RSD＝0.6%。
3.6 重复性试验
称取同一批号的样品(批号080102)颗粒0.8 g,精密称定,共6份,制备供试品溶液。按样品含量测定项下方法实验,进样量10 μL,算出RSD＝0.26%。结果表明,试验方法的重复性良好。
3.7 回收率试验
称取已知含量的样品(批号080102)6份,分别加入不同体积的2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷对照品溶液,按供试品溶液制备方法制成供试品溶液,照上述色谱条件测定。结果见表1。表1 加样回收率试验结果（略） 职称论文发表网
3.8 样品测定
取3个批号的制剂各2份,按照上述方法制备样品溶液,测定,计算2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-0-β-D-葡萄糖苷在降压益肾颗粒中的含量,结果见表2。表2 样品测定结果(略)
4 讨论
降压益肾颗粒的薄层色谱鉴别曾有过报道,但本次试验首次鉴别出该处方中的全部6味药物,且其中5味药材的供试品溶液均采用相同方法制备,较原有方法简便易行。
在玄参的薄层色谱鉴别中,曾分别用乙酸乙酯、水饱和的正丁醇萃取,展开剂也试用过正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)和氯仿-甲醇(15∶0.5)系统,显色剂试用过10%硫酸乙醇和5%香草醛浓硫酸试液,但所得到的薄层色谱显示,药材中有明显的墨绿色斑点,制剂中在与药材斑点相同位置处干扰严重。采用大孔树脂富集的方法,可以有效祛除干扰组分。但与文献[3]不同的是,所收集30%的洗脱液从中检出红色斑点,而本试验在30%洗脱液中未发现此斑点,而是在50%洗脱液中检出墨绿色斑点。
