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【摘要】 摘要:目的 建立检测注射用重组人干扰素α2b半成品中外源性DNA残留量的方法。 方法 以重组人干扰素α2b工程菌基因组DNA为模板,用地高辛标记探针,以此探针杂交并进行显色反应。 结果 半成品中每人份剂量的外源性DNA残留量均小于10 ng。 结论 该方法检测特异性较强,操作较安全简便,可用于重组人干扰素α2 b制备过程中的质量监控及半成品的检定。
【关键词】 地高辛 DNA残留量 重组人干扰素α2b
注射用重组人干扰素α2b是利用携带人白细胞干扰素α2 b基因质粒的重组大肠杆菌生产所得，具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖以及提高免疫功能等作用。主要用于治疗一些病毒性疾病，如急慢性病毒性肝炎、带状疱疹、尖锐湿疣等。由于在生产过程中使用了工程菌大肠杆菌,而宿主菌的残留DNA是重组药物中特有的潜在致癌性杂质,因此对干扰素α2 b半成品中外源性DNA残留量的检测极为重要［1，2］。本文使用地高辛标记探针杂交法检测注射用重组人干扰素α2 b半成品中的外源性DNA残留量，操作较安全简便,可用于重组人干扰素α2 b制备过程中的质量监控，从而保证了其安全性,符合相关质控标准［3］。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
重组人干扰素α2b工程菌的宿主菌（北京生研所）和重组人干扰素α2b半成品(深圳海王英特龙生物技术有限公司提供)；地高辛标记和检测试剂盒（Roche）；正电荷尼龙膜（Millipore）；细菌基因组DNA提取试剂盒（DP2001,北京百泰克生物技术有限公司）；蛋白酶K（Amresco）；鲱鱼精DNA（Sigma）；其余试剂均为分析纯。
1.2 工程菌基因组DNA的制备
大肠杆菌的基因组DNA通过百泰克细菌基因组DNA提取试剂盒制备,并通过1%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法测定提取的DNA纯度和浓度,并将提取的DNA于-20 ℃冻存备用。
1.3 探针的制备
取1 μg基因组DNA,加入无菌双蒸水至终体积15 μL,沸水浴10 min 后, 迅速转入冰浴中冷却。取Hexanucleotide mixture 2 μL和dNTP labeling mixture 2 μL加入变性DNA中,并加入Klenow enzyme 1 μL混匀，于37℃孵育过夜。加入0. 2 mol/L EDTA(pH8. 0)缓冲液2 μL、3mol/L醋酸钠溶液2.5 μL和无水乙醇75 μL，置－20 ℃冰箱中2 h以上。15 000 r/min离心10 min，弃去上清，沉淀用TE缓冲液复溶即得探针溶液。
1．4 探针标记效率的检测
取DIGLabeled Control DNA都稀释成1 ng/μL,分别依次稀释至10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 pg/μL,同时取标记好的探针，按上述方法依次稀释，然后分别取各浓度点样10 μL于尼龙膜上,经固定和封闭后, 通过AP缓冲液和NBT/BCIP进行显色反应,比较两者显色深浅从而确定标记探针的浓度。
1.5 样品的处理
取2批重组人干扰素α2b半成品,用DNA稀释缓冲液将样品稀释至含每100 μL含1/10人份剂量备用。
1．6 外源性DNA残留量的检测
将2批半成品、阳性对照（基因组DNA）、阴性对照（DNA稀释液）和空白（TE缓冲液）经蛋白酶K预处理后［4］，沸水浴10 min，立即冰浴冷却，8 000 r/min离心5 s，点膜、固定、68 ℃杂交过夜，之后用AP缓冲液和NBT/BCIP进行显色反应，与阳性对照比较，根据显色深浅判定半成品中外源性DNA的含量。
1.7 重现性试验
按上述检测方法，对2批重组人干扰素α2 b半成品重复测定3次，比较3次的结果，考察该检测方法的重现性。
2 结果
2．1 工程菌基因组DNA
取部分基因组DNA电泳,结果见图1。结果表明制备的基因组DNA完整性较好,A260/A280比值为1.85,纯度符合要求。
M.DNA maker;1.engineering bacteria genome DNA
图1 工程菌基因组DNA电泳图（略）
Figure 1 Electrophoresis of engineering bacteria genome DNA
2．2 探针标记效率的检测
探针标记效率的检测结果见图2。从图中可见，标记探针0.1 pg稀释点可见显色,表明标记探针达到预期的标记效率,而且效率较高,经比较两者显色深浅,表明标记达到要求的量,确定探针浓度为100 ng/μL,总量为2 000 ng。
图2 探针标记效率检测图（略）
Figure 2 Detection of probe labeling efficiency
2．3 重组人干扰素α2 b半成品中外源性DNA残留量的检测
用标记的探针检测干扰素α2 b半成品中DNA的残留量，结果见图3。结果表明，1/10人份剂量的2批半成品中外源性DNA残留量均小于1 ng,因此1人份剂量的半成品中DNA残留量小于10 ng。
2．4 重现性试验
按上述检测方法，对2批重组人干扰素α2 b半成品重复测定3次，3次的测定结果一致，均为1人份剂量的半成品中DNA残留量小于10 ng，则表明该方法的重现性较好。
A1～A3: The content of standard DNA were 0.1,1,10 ng/100μL; A4: Negative control; A5: Blank control; B1～B2: The two batches of semi-finished products
图3 注射用重组人干扰素α2b半成品中外源性DNA残留量检测图（略）
Figure 3 Detection of residual DNA in semifinished products of recombinant human interferon α2b for injection
3 讨论
以往DNA残留量的检测大都采用同位素法，因此操作人员会受到放射性同位素辐射的危害。地高辛标记探针法则避免了放射性的危害，且探针法操作较简便，也避免了同位素检测时包片曝光等诸多环节导致的实验结果误差［5，6］。在探针法中总DNA的提取可用不携带表达基因的细菌，也可用重组的工程菌，提取的总DNA中不应被RNA或蛋白污染，否则将会影响到紫外定量的准确性，同时也会影响到标记探针的灵敏度和特异性。在杂交过程中，杂交液的pH值对反应的灵敏度影响较大。通过本文的研究发现，地高辛标记探针法测定DNA的残留量有着特异性高、操作简便和重现性好的特点，可以用于注射用重组人干扰素α2b生产过程中的质量监控,从而保证其安全性,符合国家制定的相关质量控制标准,也可以推广至其他重组大肠杆菌生物制品中DNA残留量的检测。
【参考文献】
［1］ 佘清.第57届WHO生物制品标准化专家委员会会议简况［J］.中国药品标准,2007,8(1):77-79.
［2］ MARTINS S A M, PRAZERES D M F, CABRAL M S, et al.Comparison of realtime polymerase chain reaction and hybridization assays for the detection of E. coli genomic DNA in process sample and pharmaceutical grade plasmid DNA products ［J］. Anl Biochem, 2003,322:127-129.
［3］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2005年版三部［S］.北京：化学工业出版社，2005：附录46-47.
［4］ 蔡旭，马端，宋后燕.地高辛标记探针检测重组双功能水蛭素中的DNA残留量［J］.药物生物技术，2004，11（6）：392-394.
［5］ JI X, LEE K, DIPAOLO B. Highsensitivity hybrization assay for quantitation of residual E. coli DNA［J］. Biotechniq, 2002,32:1162.
［6］ 刘君，张振龙.地高辛标记探针检测重组人干扰素β1b中DNA残留量［J］.微生物学免疫学进展，2007，35（2）：19-20.
