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提 要:目的 探索6号染色体的有关微卫星标记与哮喘表型的关系。方法 对20个哮喘同胞及核心家系成员分别测定支气管反应性、总IgE、皮肤挑刺试验和外周血嗜酸性粒细胞的测定,并以此为哮喘的表型,与分布于6号染色体的16个微卫星标记进行连锁不平衡分析。用ETDT软件软件系统完成所有连锁不平衡分析。结果 在4种不同表型下,只有D6S1610位点与特应症的皮肤挑刺试验的连锁不平衡关系具有显著性意义。结论 6号染色体短臂D6S1610附近可能存在特应症的易感基因。
群体遗传学研究结果表明哮喘属于多基因遗传性疾病,其遗传度大约为60%~80%。目前分子遗传学研究提示,最有可能包括哮喘易感基因的区域分别为6号染色体短臂、5号染色体长臂和11号染色体长臂[1~3]。并且,有研究发现6号染色体短臂可能有与特应症有关的基因位点[4]。为此,我们进行了哮喘和特应症表型与分布在6号染色体全长的16个微卫星标记的多态性之间的连锁不平衡研究,从而探讨这些位点及其附近区域是否可能包含与哮喘表型有关的遗传易感基因。
1 资料与方法
1•1 对象 居住在重庆市哮喘家系20个,其中同胞家系11个,核心家系19个。根据支气管哮喘防治指南[5 ]的哮喘诊断标准进行诊断,对家系成员做总IgE测定、皮肤挑刺试验、支气管激发试验或支气管舒张试验和外周血嗜酸性粒细胞。并以此四种表型与6号染色体上的标记做连锁不平衡分析。
1•2 基因组DNA的提取 采用酚/氯仿抽提法。抽取3 ml外周静脉血,分别用于生化检测和DNA抽提,可获得DNA 100μg左右。所得DNA用0•8%琼脂糖凝胶电泳鉴定,确认无RNA污染,DNA分子量完整。检测A260/A280在1.8~1.9。-20℃冷藏保存。
1•3 哮喘家系微卫星标志的基因分型
1•3•1 荧光标记引物 采用美国Perkin Elmer公司产品,共16对(Linkage mapping set version 2.5)。平均杂合度在0.79。分布于6号染色体。每对引物的正义链末端(5′端)标记荧光染料(FAM,HEX,NED),通过激光扫描,3者分别显示蓝、绿、黄色。6号染色体的微卫星DNA标记位点的有关资料见表1。
1•3•2 多重PCR反应 在96孔微量反应板上进行。根据引物多少、颜色、产物长度将每组引物分1到2次扩增。反应体系包括基因组DNA 1•0μl,GoldenTaq聚合酶0.04μl,Mg2+0•6μl,每对引物各0•04μl,10×buffer 0•5μl,ddH2O2•60μl,dNTP 0•1μl,总反应体积5μl。用Touch-down PCR优化最佳反应条件。
1•3•3 毛细管微列阵电泳 将稀释后的PCR产物与含有去离子甲酰胺的内部分子量标准按一定比例混合,94℃变性2min,在毛细管微列阵电泳仪Megabace1000上进行电泳1~2 h,系统软件进行图像扫描及信息收集。不同荧光标记的PCR产物或同种荧光标记但扩增片段相差50 bp以上可以混合在同一毛细管中电泳。
1•3•4 基因分型 应用Genetic Profiler2.1软件分析收集到的信息,并对每个成员的每个微卫星位点进行基因分型,以及家系内遗传关系的鉴定。所有数据以Excel表形式保存。
1•4 统计学分析 采用ETDT(version2.2)软件进行χ2检验。
2 结果
同时扩增16个微卫星位点,并分别在4中不同的表型分类范围下,对所有16个微卫星位点进行ETDT检验。结果显示D6S1610与皮肤挑刺试验P值达到显著性水平,ETDT-P值经Monte Carlo逼真法10 000次重复校正后的经验P值小于0•05具有统计学意义,显示D6S1610与特应症的易感基因存在连锁不平衡,其他D6S1574、D6S262、D6S309、D6S441、D6S264、D6S276、D6S422、D6S1581、D6S287、D6S289、D6S308、D6S462、D6S460、D6S446、D6S434,P>0.05,均不存在连锁不平衡。
3 讨论
连锁不平衡方法(Transmission disequilibrium test,TDT)是遗传统计学研究发展起来的介于连锁和关联分析的一种新方法,以患病子代与其与父母组成的核心小家系为研究对象,把父母作为患者的“内对照”,这在比较分析两组人群遗传背景完全相同,有效地消除了在群体关联研究中难以避免的群体分层等因素所导致的假阳性,因而具有明显的优越性[6]。并且具有TDT分析不受遗传模式影响,如果阳性,暗示一个非常小的区域的优点。我们在哮喘的同胞对核心家系中采用了TDT分析方法,在所选用的16个标记位点中,发现D6S1610有统计学意义(P<0.01),提示D6S1610位点与哮喘病人的特应症易感基因存在连锁不平衡。因为微卫星DNA序列本身并不编码蛋白质,它只作为遗传标记,因此该结果提示该位点不仅可作为哮喘的重要遗传标记,更重要的是表明其附近可能存在与哮喘相关的基因。与国外常用的连锁分析相比较,连锁不平衡检验具有能检验较弱的连锁位点,因而其在遗传定位方面具有优势,目前有学者认为关联分析是未来复杂遗传性疾病定位的最有用的工具。目前国内还未见哮喘相关方面的报道。
D6S1610位点位于6p22.1~6q25.3区域,其中组织相容性白细胞抗原(HLA)基因位点位于6q22。HLA的Ⅱ类抗原(包括DP、DQ、DR)在抗原提呈过程中起关键作用,因而影响免疫反应的特异性。以往人们对Ⅱ类抗原等位基因与某些特殊抗原的IgE高反应性之间的关系进行了研究。在染色体6q21的标记和花粉特异性IgE存在连锁[7]并且HLA-Derp1*1101,DQA1*0501,DQB1*0301与过敏性哮喘有很强的相关性[8]。也有报道MHC与特应症没有相关性,在最早的报道中Maryland组研究,20个家系在8岁时期疾病表型是气道高反应性,用高度多态性标记定位人类基因组11与HLA-DR非常靠近,显示这些位点与特应性和气道高反应性没有关联[9];在德国、新西兰和西班牙的进一步研究,也没有发现HLAⅡ类座位与对屋尘螨反应有显著关联[10~12]。在中国北方汉族发现HLA-DQ和HLA-DR与支气管哮喘的易感性有关[13~14]。而本研究用TDT检验哮喘遗传家系的四个表型,仅发现抗原特异性的皮肤挑刺试验与D6S1610有关,提示在D6S1610附近可能存在有特应症的易感基因。至于是否是HLA或其它基因还需要进一步的研究。
参考文献:
[1] Daniels S E, Bhattacharrya S, James A,et al. A genome-wide search forquantitative trait loci underlying asthma[J]. Nature, 1996,383(6597):247-250•
[2] Ober C, Cox N J, Abney M,et al. Genome-wide search for asthma sus-ceptibility loci in a founder population. Collaborative Study on the Geneticsof Asthma[J]. HumMol Genet, 1998,7(3):1393-1398•
[3] Green S L, Gaillard MC, Song E,et al. Polymorphisms of the beta chainof the high-affinity immunoglobulin E receptor (Fcepsilon RI-beta) in SouthAfrican black and white ashmatic and nonasthmatic inpiduals[J]. Am JRespir Crit Care Med, 1998,158(5 Pt 1):1487-1492•
[4] Albuquerque R V, Hayden C M, Palmer L J,et al. Association of poly-morphismswithin the tumour necrosis factor (TNF) genes and childhoodasthma[J]. Clin Exp Allergy, 1998,28(5):578-584•
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