[Smad蛋白在BMP2诱导成骨分化过程中的作用]诱导分化

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【摘要】目的研究Smad蛋白在骨形态发生蛋白2(BMP2)诱导成骨分化过程中作用，探讨Smad蛋白在成骨分化期间信号传导的机制。方法将取自MDX大鼠颅盖骨组织分离获得成骨细胞进行培养，培养的成骨细胞分组，加入不同浓度的BMP2或BMP2与Trx2SARA混合物后，用反义PCR和Western Blot斑点杂交对各组诱导成骨分化的情况进行分析。体内实验中肌肉局部埋植BMP2或BMP2和Trx2SARA，取不同时间点处死动物，制备组织切片，用SO染色进行组织学观察。结果 BMP2处理的成骨细胞碱性磷酸酶增加，降钙素mRNA增加，Smad蛋白的表达水平呈剂量依赖性增加。Trx2SARA处理组出现碱性磷酸酶和降钙素mRNA下调。体内实验组织切片SO染色显示，BMP2处理组大部分异位组织由增殖中、肥厚前和肥厚软骨细胞构成，而Trx2SARA处理组很少向软骨源细胞分化。结论 Smad蛋白在BMP2诱导成骨分化中发挥重要的信号传导作用。

【关键词】 Smad蛋白质类骨形态发生蛋白质类成骨分化

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of Smad protein on osteogenesis induced by bone morphogenetic protein2 (BMP2) signal.MethodsPrimary calvarial osteoblasts were pided into three groups. Group Ⅰ were treated with BMP2; group Ⅱ with BMP2 and Trx2SARA; group Ⅲ as control without any treatment. Reverse transcription PCR (RTPCR) and Western Blot were applied to analyse differenciation of osteoblasts. BMP2 and Trx2SARA were also injected into gluteus of mice. Tissue samples were obtained from the site of injection for histological SO staining.ResultsExpressions of both alkaline phosphatase (ALP) and calcitonin mRNA of the osteoblasts from group Ⅰ increased, Smads level increased in a dosedependent manner. While the expression of ALP and calcitonin mRNA in group Ⅱ showed a significant downregulation. Histological SO staining showed that BMP2 treated tissues were composed of cartilage with large population of proliferating, prehypertrophic and hypertrophic chondrocytes. In contrast, Trx2SARA and BMP2 treated tissues exhibited seldom chondrogenic differentiation.ConclusionSmad protien plays an important role in osteogenesis induced by BMP2 signaling.

［KEY WORDS］Smad proteins; bone morphogenetic proteins; osteoblast differentiation; mechanism

骨形态发生蛋白2(BMP2)是转化生长因子β（TGFβ）家族成员之一，可促进多种细胞的生长、分化和抑制细胞的凋亡。在生长发育过程中，BMP2是调节成骨的重要生长因子。然而，关于BMP2在诱导成骨分化方面的作用机制目前尚不清楚。为此，本研究旨在分析Smad蛋白在BMP2诱导新骨形成过程中的作用，探讨Smad蛋白在BMP2诱导成骨分化过程中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选择雄性MDX小鼠12只， 2～3周龄，体质量27～35 g。

1.2 细胞培养

取MDX小鼠的颅盖骨，通过一系列酶消化方法分离获得成骨细胞[1]，进行细胞培养，在培养板上细胞达到80%的融合后分组，各组分别加入500、200、0 mg/L的BMP2 作用24 h，收获细胞进行蛋白和RNA分析。为观察BMP2诱导长期的成骨细胞分化，将培养的成骨细胞又分为3组：1组加入浓度为500 mg/L的BMP2，2组加入BMP2和Trx2SARA，3组不加入任何物质做为对照。5 d后对细胞进行蛋白和RNA分析。

1.3 反义PCR(RTPCR)和Western Blot斑点杂交分析

总RNA应用TRIzol Regent提取液提取，定量RTPCR和Western Blot斑点分析均按照CHOEN等[2]的方法进行。

1.4 体内实验

选择2～3周龄成年雄性大鼠。腹膜外注射咪达唑仑针剂(12.5 mg/kg)深度麻醉30 min。右下肢备皮无菌准备后，在臀部背面做5 mm长的皮肤切口，于臀肌内通过钝性分离制作一个肌腔隙。将动物分为两组：BMP2注射组（Ⅰ组）和BMP2与Trx2SARA注射组（Ⅱ组）。Ⅰ组和Ⅱ组于海绵内装填50 μg的BMP2，海绵冻干放入肌袋内，用50可吸收线间断缝合肌肉和皮肤组织。在BMP2植入前2 d，Ⅱ组动物注射10 μg/L的Trx2SARA。苏醒后笼内放养，正常进食、饮水。在手术后2周处死动物。标本用40 g/L的多聚甲醛固定3 d，4 ℃下在200 g/L EDTA(pH 7.4)中脱钙5 d。脱钙后，标本用梯度乙醇脱水，石蜡包埋，10 μm厚切片，置于TESPA处理的载玻片上。切片脱蜡，通过梯度乙醇浸入水中重新水化，随后进行SO染色行组织学观察。

2 结果

应用不同剂量的BMP2处理24 h，BMP2处理的成骨细胞主要向成骨细胞分化，表现为碱性磷酸酶（ALP）和降钙素mRNA增加，以及成骨细胞分化的基因表达增加(图1)。Western Blot杂交显示 Smad蛋白的表达水平呈剂量依赖性升高(图2)。BMP2和Trx2SARA处理的成骨细胞，ALP和降钙素mRNA水平下降（图3、4）。

组织切片SO染色显示，术后2周BMP2处理组大部分异位组织由增殖中、肥厚前和肥厚软骨细胞的软骨构成(图5)。Trx2SARA处理组很少向软骨源性分化，很少观察到肥厚软骨细胞(图6)。

3 讨论

骨形态发生蛋白是从骨基质分离提纯的一类能高效诱导骨、软骨组织发生的酸性糖蛋白，是一组结构相关性的多功能细胞因子,具有广泛的生物学活性，如参与早期胚胎发生的身体构建，控制软骨、骨和性器官的形成，促进组织修复，调节细胞的增殖、凋亡、分化和迁移，调节免疫和内分泌功能等。到目前为止,共发现了30多种的骨形态发生蛋白[3]。BMP可分为几个亚族，BMP2和BMP4结构高度相似，BMP5、BMP6、BMP7和BMP8在结构上相似，BMP2、BMP4、BMP6和BMP7在体内可诱导骨和软骨形成[4]。

Smad蛋白家族是近年发现的新的细胞内信号传导蛋白，直接参与骨形态发生蛋白等多个成员的信号转导[5～7]。在胚胎发生、个体形成、非对称器官的形成过程中具有重要作用。在哺乳动物目前已经分离获得8种类型的Smad蛋白，根据其结构和功能它们又被分为3个亚型：受体调节的Smads 蛋白（RSmad）、共同介导的Smads蛋白（coSmad）和抑制性Smads蛋白（antiSmad）[8]。来自BMP家族成员的信号作用于Ⅱ和Ⅰ型丝氨酸苏氨酸激酶受体,而后通过细胞内的多种蛋白传导其信号。活化的Ⅰ型受体与特定的RSmad相互作用,并将其磷酸化。活化的RSmad与CoSmad形成异聚复合体,并在核内积聚。核内的异聚复合体可以直接或者通过其他DNA结合蛋白间接与DNA结合,从而调节靶基因的转录。在Smad信号转导过程中也受到一些抑制信号的影响，如一种特异性的阻断Smad 信号转导通路的肽适体——Trx2SARA[9],其关键作用是在BMP 刺激时减少Smad2、Smad3与Smad4形成的复合体，同时介导活性Smad复合体的降解。

本研究中BMP2处理的成骨细胞向成骨分化，表现为ALP增加，降钙素mRNA增加，成骨细胞分化的基因表达增加以及Smad蛋白的表达水平剂量依赖性增加。结果表明，BMP2介导成骨分化期间Smad蛋白信号激活。为研究Smad信号对成熟成骨细胞的作用效果，本研究探讨了Smad信号途径对BMP2诱导长期成骨分化的调节作用。实验中用特异性的阻断Smad信号转导通路的Trx2SARA和BMP2一起处理小鼠颅盖骨成骨细胞，结果Trx2SARA对碱性磷酸酶和降钙素mRNA水平起到抑制作用，可见Smad信号失调抑制了BMP2介导的成骨细胞分化。体内实验表明，Trx2SARA介导Smad蛋白的失活抑制了BMP2介导的软骨的形成，提示Smad蛋白在BMP2诱导软骨骨形成过程中起到重要作用。

【参考文献】

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