【联合转染Survivin和Bcl2反义寡核苷酸对裸鼠胆囊癌生长的抑制作用】反义寡核苷酸

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【摘要】目的探讨联合转染Survivin和Bcl2反义寡核苷酸（AsODN）对裸鼠胆囊癌生长抑制作用。方法建立裸鼠胆囊癌皮下移植瘤模型，选择36只裸鼠随机分为3组：对照组、正义寡核苷酸（sODN）组和AsODN组，裸鼠瘤体内分别注射PBS、Survivin和Bcl2 sODN、Survivin和Bcl2 AsODN， 12 d后处死裸鼠，测量瘤体体积及质量，计算抑瘤率；苏木精伊红染色观察瘤体组织学变化；免疫组织化学方法检测Survivin及Bcl2蛋白的表达。结果 AsODN组裸鼠瘤体平均体积显著低于对照组、sODN组（F=24.469，q=8.802、7.569，P<0.01），其体积抑瘤率为55.53%，sODN组为 9.90%；AsODN组裸鼠瘤体平均质量显著低于对照组、sODN组（F=25.376，q=3.168、20.737，P<0.01），其质量抑瘤率为56.24%，sODN组为 8.47%。AsODN组瘤体中可见大量的凋亡细胞。免疫组化证实AsODN组Survivin表达明显降低，同sODN组相比差异有显著意义（F=15.103， q=5.883、7.191，P<0.01）；Bcl2表达亦明显降低，同sODN组相比差异有显著性（F=6.632，q=4.793、4.030，P<0.05）。结论联合转染Survivin和Bcl2 AsODN可下调Survivin和Bcl2表达，诱发细胞凋亡，从而抑制裸鼠胆囊癌种植瘤的生长。

【关键词】胆囊肿瘤寡核苷酸反义 Survivin Bcl2 模型动物

［ABSTRACT］ObjectiveTo evaluate the inhibitory action of combining antisense oligonucleotide targeting Survivin and Bcl2 on growth of gallbladder carcinoma in nude mouse.MethodsA model of human gallbladder carcinoma transplanted subcutaneously in nude mice was established. A total of 36 mice were pided into three groups: control group, Survivin and Bcl2 sODN group, as well as survivin and Bcl2 AsODN group. Twelve days later, the weight and volume of the tumor were measured and histology observed by HE staining, the expression of survivin and Bcl2 protein detected by immunohistochemistry SABC method.ResultsThe mean volume and weight of the tumors of AsODN group were significantly lower than that of the controls and sODN group (F=24.469,25.376;q=3.168-20.737;P<0.01). The inhibition rate of volume and weight of AsODN group was 55.53% and 56.24%, respectively, while that of sODN group was 9.90% and 8.47%. A lot of apoptotic cells were seen in tissue sections with HE staining, and the expression of survivin and Bcl2 protein was markedly lower than that of the control group and sODN group (F=15.103,6.632;q=4.030-7.191;P<0.05). ConclusionCombining antisense oligonucleotide targeting survivin and Bcl2 could inhibit the growth of subcutaneous tumors in nude mice, the reason might be that they could downregulate the expression of survivin and Bcl2 and induce apoptosis of gallbladder carcinoma cell.

［KEY WORDS］gallbladder neoplasms; oligonucleotides, antisense; Survivin; Bcl2; models, animal

反义核酸技术是近年兴起的一种生物技术，是肿瘤基因治疗的策略之一，其基本原理是根据碱基互补原则，用人工合成或生物体表达的特定互补的DNA或RNA片段（反义核酸）抑制或封闭专一靶基因表达的技术［1，2］。Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中一个结构独特的成员，特异性地表达于胚胎发育组织以及多数人类肿瘤细胞，因为其表达的特异性，故可作为肿瘤治疗的新靶点。Bcl2是最早发现的抑制细胞凋亡的蛋白，由bcl2编码，研究表明，bcl2基因的易位和高表达与肿瘤的发生密切相关。国内外的研究表明，Bcl2反义RNA可使一些肿瘤细胞Bcl2蛋白减少，细胞凋亡增加［3］。本研究建立裸鼠胆囊癌皮下移植瘤模型，观察联合应用Survivin和bcl2的反义寡核苷酸（AsODN）对裸鼠胆囊癌的抑制效果，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 寡核苷酸（ODN）针对Survivin mRNA的AsODN序列为5′GGGGCACCCATGCCGCCGCC3′，正义寡核苷酸（sODN）序列为5′GGCGGCGGCATGGGTGCCC3′；针对Bcl2 mRNA的AsODN编码序列为5′CAGCGTGCGCCATCCTTCCC3′，sODN序列为5′GGGAAGGATGGCGCACGCTG3′。AsODN及sODN序列由上海生物工程公司采用DNA自动合成仪合成。

1.1.2 试剂 RPMI 1640培养液及小牛血清购自杭州四季青公司。兔抗人Survivin多克隆抗体、兔抗人Bcl2多克隆抗体、SABC及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司。

1.1.3 细胞株胆囊癌细胞株GBCSD系山东大学齐鲁医院普外科构建。

1.1.4 实验动物 BALB/cnu/nu裸小鼠，4～6周龄，雌雄兼用，体质量18～23 g，购自中国医学科学院实验动物研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 裸小鼠胆囊癌模型的建立取处于对数生长期1×1010/L的GBCSD胆囊癌细胞，于每只裸鼠一侧背部皮下接种0.2 mL单细胞悬液，以皮下结节直径超过0.5 cm为成瘤标准。所有裸鼠于接种细胞后2周左右成瘤，成瘤率100％。

1.2.2 抑制种植瘤实验取成瘤后裸鼠36只，称体质量后随机分为3组，每组12只。对照组每只裸鼠瘤体内多点注射PBS 0.3 mL， sODN组每只裸鼠瘤体内多点注射50 μL脂质体( Lipofectin)+Survivin sODN及Bcl2 sODN各100 μg（0.3 mL），AsODN组每只裸鼠瘤体内均行多点注射50 μL的Lipofectin＋Survivin AsODN及Bcl2 AsODN各100 μg（0.3 mL），每天注射1次。于注射后12 d断颈处死裸鼠，剥离肿瘤，分别测量肿瘤长轴（L）、短轴（W），根据公式V=1/2 LW2计算肿瘤体积，称量瘤质量。然后将肿瘤组织储存于液氮中备用。肿瘤生长抑制率计算公式为：体积抑制率＝（1-治疗组平均体积/对照组平均体积）×100％，质量抑制率＝（1-治疗组平均质量/对照组平均质量）×100％。

1.2.3 Survivin及Bcl2蛋白表达的检测采用免疫组织化学（SABC）法。

1.2.4 染色结果判定标准细胞浆染成黄色或棕黄色为阳性染色。采用Leica全自动图像分析系统（德国），以阳性单位（PU）表示染色强度。随机选取5个高倍视野，选取灰度参数，计算 PU。PU＝页码：123

【联合转染Survivin和Bcl2反义寡核苷酸对裸鼠胆囊癌生长的抑制作用】 反义寡核苷酸

【联合转染Survivin和Bcl2反义寡核苷酸对裸鼠胆囊癌生长的抑制作用】反义寡核苷酸