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【摘要】 目的 探讨红霉素（EM）在中枢的拟胃动素作用及其可能的机制。方法 应用核团微量注射法，记录清醒大鼠胃运动，观察侧脑室分别注射生理盐水、不同剂量的EM（9.16、 45.78、 91.56 nmol）及胃动素受体拮抗剂（91.56 nmol EM+2.95 nmol GM109） 后， 对清醒自由活动大鼠胃运动的影响；应用免疫组织化学方法，观察侧脑室分别注射生理盐水、不同剂量的EM （45.78、91.56 nmol）及胃动素受体拮抗剂（91.56 nmol EM+2.95 nmol GM109）后，大鼠室旁核（PVN）内cFos蛋白的表达。结果 与生理盐水组相比，侧脑室微量注射EM后，清醒大鼠胃运动增强，增强的幅度与EM呈剂量依赖性，其中45.78 nmol EM组胃收缩幅度增加在5、10 min时差异有显著性（F=32.14、36.24,q=3.46、2.14,P<0.01），91.56 nmol EM组胃运动幅度增加在5、10、15、20 min时差异有显著性（F=35.32～39.44,q=2.56～3.26,P<0.01），9.16 nmol EM组胃运动变化均无统计学差异。GM109可以部分阻断91.56 nmol EM的促胃运动作用。侧脑室微量注射不同剂量的EM可以诱导下丘脑室旁核神经元cFos蛋白的表达，具有剂量依赖性，2.95 nmol GM109可以部分阻断91.56 nmol EM诱导的下丘脑室旁核cFos蛋白的表达。生理盐水组只有极低水平的cFos的表达。结论 EM侧脑室注射具有胃动素样的促进胃运动的作用，这种作用可能是通过中枢胃动素受体介导的；下丘脑室旁核可能是EM发挥中枢作用的作用部位之一。
【关键词】 红霉素 胃动素 cfos蛋白 受体拮抗剂 室旁核 胃运动
［ABSTRACT］ObjectiveTo study whether EM has a motilinlike effect on CNS and its possible mechanism. MethodsGastric motility was recorded in conscious rats after I.C.V. microinjection of normal saline, different dosage of EM (9.16 nmol, 45.78 nmol, 91.56 nmol), and EM 91.56 nmol+GM109 2.95 nmol. The expression of cFos protein in the brain was detected with immunohistochemistry technique 90 minutes after injection of normal saline, EM(45.78 nmol, 91.56 nmol), or EM 91.56 nmol+GM109 2.95 nmol into the lateral cerebroventricle.ResultsA dosedependent motilitystimulating effect of EM on the gastric motor amplitude in conscious rats was observed, the difference of amplitude between the EM 45.78 nmol and NS were significant in 10 minutes after injection (F=32.14,36.24,q=3.46,2.14,P<0.01). The difference of amplitude between the EM 91.56 nmol and NS were significant in 20 minutes after the injection (F=35.32-39.44,q=2.56-3.26,P<0.001). GM109 2.95 nmol can partially blocked the stimulating effect of EM 91.56 nmol on the gastric motor amplitude. I.C.V. injection of EM 45.78 nmol or EM 91.56 nmol induced the expression of cFos protein in PVN in a dosedependent manner. GM109 2.95 nmol partially blocked the effect EM 91.56 nmol on cFos expression in PVN.ConclusionI. C. V. injection of EM has a motilitystimulating effect on gastric motor amplitude in conscious rats, which might be mediated by the central motilin receptor; I. C. V. injection of EM induces the expression of cFos protein in PVN, which indicates that one of the possible regions where EM exerts its motilinlike effect is PVN.
［KEY WORDS］erythromycin; motilin; cFos protein; receptor antagonist; PVN; gastric motility
胃动素（MT）是由22个氨基酸残基组成的脑肠肽,在消化间期周期性释放，诱发胃肠道消化间期的移行性运动综合波(MMC)的Ⅲ相收缩活动[1,2]。在中枢与摄食相关的核团中如下丘脑腹内侧核、下丘脑外侧区、海马、室旁核等，微量注射外源性MT可以增强清醒大鼠胃运动[3～5]。红霉素(EM)是最早被确认的MT的外周作用拟似剂，有许多研究证明，EM在外周具有MT样的生物学作用[6,7]。本实验室在以往的实验中观察到，侧脑室注射EM会引起糖尿病大鼠胃运动增强[8]。但EM在正常大鼠脑内是否同外周一样具有MT样作用迄今未见报道。本文采用侧脑室注射EM观察清醒大鼠胃运动变化和中枢有关核团cFos蛋白表达的方法，探讨EM对胃肠的作用及其机制，从而为胃肠道运动的中枢调控机制的研究以及对促胃动力药物的开发研究提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 动物及分组
选用健康成年Wistar大鼠30只，体质量200～250 g，雌雄不限，由青岛市药检所提供。置25 ℃室温下，昼夜循环光照，自由饮水。大鼠随机分为5组：生理盐水组（A组）、9.16 nmol EM组（B组）、45.78 nmol EM组（C组）、91.56 nmol EM组（D组）以及胃动素受体拮抗剂（91.56 nmol EM+2.95 nmol GM109）组（E组）， 每组6只。
1.2 实验方法
1.2.1 侧脑室埋管 术前动物禁食15～20 h，自由饮水，80 g/L水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，用耳杠将大鼠头部固定在立体定位仪上，参照PaxisonWaston图谱（1982），将微量注射用套管植入侧脑室（AP：0.8 mm，L：1.4 mm，D：3.5 mm），牙托粉固定于颅骨。
1.2.2 胃窦部应力传感器（应变片）植入 牙托粉凝固结实后将大鼠从立体定位架上取下，置于手术台上，行腹部手术，暴露胃，在距幽门0.5 cm处，将应变片沿胃环行肌方向缝帖于胃窦浆膜面，绝缘导线经皮下引至颈后部皮肤切口，穿出体外。术后3 d每天常规给予青霉素5万单位，7 d后即可进行实验。
1.2.3 清醒动物胃运动记录 实验开始前，动物禁食15～20 h，自由饮水。实验开始，首先将大鼠置于特制鼠笼内适应实验室环境1 h。记录正常大鼠胃运动，记录时间30～60 min，统计大鼠胃运动的幅度。观察侧脑室注射EM及GM109后5、10、15、20、25 min，清醒大鼠胃运动幅度变化率的变化。
1.2.4 cFos蛋白表达的检测 采用免疫组化染色。胃运动记录完毕后，快速处死大鼠，灌注取脑，冷冻切片，片厚25 μm。cFos蛋白免疫组化染色（按试剂盒说明进行），应用镍盐增强紫蓝色DAB避光显色，最后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。烤箱内烘干后显微镜下观察。
1.3 统计学分析
计量资料采用±s表示。应用SPSS 10.0统计学处理软件进行均数间单因素方差分析（oneway ANOVA）、Dunnet t检验及t检验等统计学处理。
2 结 果
2.1 侧脑室注射EM及GM109对清醒大鼠胃运动的影响
与A组比较，5、10、15、20、25 min B组胃收缩幅度变化率差异无显著意义(F=15.98～39.44，q=2.62～6.19，P>0.05)；C组胃收缩幅度变化率在5、10 min时差异有显著性（q=3.46、2.14,P<0.01），15 min时差异无显著意义（q=2.13,P>0.05）；D组胃收缩幅度变化率在5、10、15、20 min时差异显著（q=2.56～3.26,P<0.01），25 min时差异无显著意义（q=1.43,P>0.05）；E组胃收缩幅度变化率在5 min时差异有显著意义（q=3.24,P<0.01）,在10 min时差异无显著意义（q=1.43,P>0.05）。E组与D组比较，胃运动幅度增加量下降，胃运动幅度增加持续时间缩短。但在5 min时E组虽然较D组胃运动幅度变化率下降，但两组差别无统计学意义(q=2.19, P>0.05)，在10 min时两组差别有统计学意义（q=3.15,P<0.05）。见表1。 表1 侧脑室注射EM或EM加GM109对清醒大鼠胃收缩幅度变化率的影响
2.2 侧脑室注射EM及GM109对脑有关核团cFos蛋白表达的影响
A组大鼠下丘脑室旁核仅见少量cFos免疫反应阳性细胞（20.5±3.56），染色很浅。C、D组下丘脑室旁核cFos蛋白免疫反应性阳性细胞数增多（分别为70.08±5.04、95.08±8.37），表达明显增强，染色呈深紫蓝色，与A组比较，C、D组阳性细胞数增多，差异有显著性(t=8.01、8.09，P<0.01)。
3 讨 论
EM是一种常用的大环内酯类抗生素，其胃肠道副作用一直是令医生和病人头痛的问题，但自从1984年ITOH发现EM可以诱发与MT相似的胃肠道收缩活动以来[8]，人们对这一古老抗生素又加以重新审视。随后EM及其衍生物被成功地用于糖尿病胃轻瘫和其他胃肠排空功能障碍的治疗[1]。GM109是一种特异性的MT受体拮抗剂，该化合物在离体的情况下可以竞争性抑制MT诱导的兔十二指肠组织的收缩作用，并可抑制125IMT与兔胃窦或十二指肠平滑肌组织匀浆受体的结合[9]。在本实验中EM侧脑室注射可以使清醒大鼠胃运动增强，并呈一定的剂量依赖性。GM109可以部分阻断这种效应，提示EM可能是通过MT受体发挥其促胃运动作用。值得注意的是,与我们用MT所得的实验结果相比[5],EM发挥促胃运动效应所需的剂量要比MT大得多。可能的解释是EM对MT受体的亲和力小，用兔小脑的MT受体所做的研究表明，这种亲和力EM比MT要小于大约两个数量级[9]。本实验表明,EM在中枢同在外周一样具有激动MT受体的作用，从这点看来中枢MT同外周MT受体一样能被EM所激活，中枢MT受体与外周MT受体在这方面的特性是相似的。
cfos癌基因是反转录病毒vfos癌基因的同源序列，是即早基因家族中的一员。cfos癌基因在细胞的静息状态下只有低水平的表达，因此细胞核内出现cFos样免疫反应阳性表示神经元被激活。本实验结合cFos蛋白免疫组织化学染色所做工作表明，中枢注射能增强胃运动的有效剂量的EM可以诱导PVN神经元cFos蛋白的表达，并且呈剂量依赖性。推测EM可以激活PVN室旁核中某一类神经元。GM109可以部分阻断EM的作用，说明MT受体可能介导EM对室旁核神经元的激活。虽然此结果尚不能肯定室旁核与EM中枢促胃运动作用有必然联系，但可以认为室旁核是EM的作用部位之一。
综上所述， EM侧脑室注射，具有胃动素样的促进清醒大鼠胃运动的作用，并且具有明显的剂量相关性，这种作用可被MT受体拮抗剂GM109部分阻断。EM侧脑室中枢注射可以诱导PVN神经元cFos蛋白的表达，GM109可以部分阻断这种作用，提示EM在中枢的作用部位可能是室旁核，中枢的EM可通过胃动素受体的介导，激活中枢内与摄食及胃肠运动相关的神经元而发挥调控胃运动的作用，为临床开发促胃动力药物及改造EM等大环内酯类药物提供有益的实验依据。
【参考文献】
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[4]张爱军，唐明，蒋正尧,等. 下丘脑外侧区胃动素对大鼠胃运动的中枢调节作用[J]. 生理学报, 2002,54(5):417421.
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[7]ITOH Z, NAKAYA M, SUZUKI T, et al. Erythromycin mimics exogenous motilin in gastrointestinal contractile activity in the dog[J]. Am J Physiol, 1984,247:G688694.
[8]刘长勤,张爱军,董静，等. 侧脑室注射红霉素对糖尿病大鼠胃窦运动的影响[J]. 青岛大学医学院学报, 2002,38(2):114116.
[9]DEPOORTERE I, PEETERS T L. Demonstration and characterization of motilin binding sites in the rabbit cerebellum[J]. Am J Physiol, 2002,272:G994999.
